Scott M. Peterman1, Andrew J. Percy2, Susan S. Bird1, Jifang Zhao3,

Masoumeh Dorrani3,Nihel Bekhti3,Jurre J. Kamphorst3

1.赛默飞Thermo

2.剑桥同位素实验室CIL 

3.Olaris

摘要

代谢组学是“组学”研究的一个新兴领域，有可能推动临床生物标志物、诊断和精准医学的新发展。已经开发了各种强大的技术来表征代谢组，从而产生了许多新的见解和观察结果。然而，事实证明，将这些发现“转化”到临床环境是困难的，部分原因是缺乏可应用于大型患者队列的标准化代谢组学方法。内部标准和有针对性的分析的结合使用能否弥合这一转化差距？

三重四极杆质谱法（QqQ-MS）的持续发展现在能够以无与伦比的灵敏度、准确性和线性范围进行全面的代谢组分析。通过使用稳定同位素标记的内标（IS）来帮助补偿基质效应，从而最大限度地实现这一点，从而能够在研究队列内和研究队列之间对生物样本进行更准确的比较。本白皮书描述了靶向代谢组学的基础，从代谢物组及其内部标准的选择到使用适当的QqQ MS设置和质量控制（QC）措施进行分析。

一

介  绍

代谢组学可以定义为对生物系统中存在的小分子（代谢物）的大规模研究。代谢产物是由各种过程动态形成、分解和调节的。这包括内源性代谢和信号传导、微生物组的代谢、饮食以及暴露于环境和药物中。本质上，代谢组提供了受试者遗传学、微生物组、生活方式和环境暴露的综合影响的实时读数。正因为如此，代谢组学独特地补充了组学的其他分支，包括基因组学和蛋白质组学。由于几乎每种疾病及其治疗都会影响新陈代谢，人们对代谢组学有很高的期望，以帮助发现药物开发、诊断和精准医学的新生物标志物。事实上，今天临床化学中一些广泛使用的测定方法都有代谢物作为读数。这包括用于糖尿病的葡萄糖、用于肾脏疾病的肌酐和用于心血管疾病的胆固醇。

由于代谢组中化学成分和浓度的广泛多样性，各种分析技术已应用于代谢组学，包括NMR和MS，以分析临床样品中的代谢物。高分辨率精确质量（HRAM）MS一直是表征代谢组的有力工具，在许多疾病领域带来了无数新的见解和候选生物标志物。使用HRAM串联质谱的非靶向数据采集通过高质量的前体和产物离子测量改进了代谢物的检测和注释。最先进的HRAM仪器具有非常高的数据采集速度，增加了样本覆盖范围。然而，当在宽的动态范围内，特别是在低水平下，对大量代谢物进行分析时，非目标数据采集可能会受到限制。

为了在临床上产生影响，需要在大型患者样本集中验证发现队列中的观察结果。这需要一个分析平台，该平台在宽的动态范围内提供高灵敏度、准确性和线性响应，并产生可以相对容易地分析并易于自动化的数据。三重四极杆（QqQ）MS与稳定同位素标记的标准物相结合，非常适合填补发现和临床实施之间的“空白”。此外，随着循环时间的提高，新一代的QqQ-MS仪器可以独立使用，全面量化临床样本中的数百种已知代谢物。

本白皮书介绍了基于QqQ-MS的标准化临床代谢组学方法的概念和考虑因素。它将介绍这种方法的优点，以及它如何与其他基于MS的代谢组学法协同工作。我们将以逐步的方式描述该方法，从代谢物小组和IS选择开始，然后是分析平台方法选择和优化策略（LC-MS/MS on QqQ），最后是确保数据质量的措施。

二

代谢组学中的QqQ MS

——使用指南选择方法

在临床代谢组学应用的背景下，与其他类型的质谱仪相比，QqQ-MS提供了多种优势。其优点中最重要的是其无与伦比的灵敏度，能够实现较低的检测和定量极限。QqQ-MS具有广泛的线性动态范围，是与稳定同位素标准结合使用的极好工具。这提高了人体样本分析的定量准确性，在代谢物水平存在巨大患者间差异的背景下，疾病特异性代谢物特征可能是微妙的。经过多年的使用，QqQ MS技术非常强大。事实上，QqQ质谱仪通常被视为质谱的“主力军”，非常适合分析大批量（100s-1000s）的样品。最后，QqQ-MS仪器提供了一个易于解释的数据分析工作流程，因此在非专业代谢组学实验室中相对容易实现。

由于QqQ MS的数据采集从根本上是有针对性的，因此首先需要考虑测量哪些代谢物。目标代谢物的列表高度依赖于上下文，但可广泛分为信息驱动的或非目标的、全面的代谢物分析实验。（图1）。信息驱动的应用基于对其他类型的质谱仪（例如，如上所述的HRAM）或已发表的文献进行的发现研究。前一种情况的一个例子是Schwaiger Haber等人的工作，他演示了如何使用高分辨率Thermo Scientific™Orbitrap™ID-X Tririd™质谱仪上获得的分析数据，在QqQ质谱仪（即Thermo Scienture TSQ Altis™和Agilent™6460）上建立选定的反应监测（SRM）方法。根据Orbitrap MS数据，作者能够确定感兴趣代谢物的最佳SRM跃迁和碰撞能量。该方法不仅适用于已知的代谢物（可获得标准），而且适用于发现实验中注释的未知物质。这种方法的使用最大限度地发挥了这两种仪器的优势，在HRAM仪器上进行了深入的发现工作，并在QqQ仪器上对大样本集进行了高度精确的后续研究.

图1。开发靶向代谢产物小组的方法可以大致分为（I）信息驱动，目标是在更大的样本集中验证发现实验或文献的发现，或（II）全面分析，目的是测量尽可能多的已知代谢产物，以揭示新的代谢产物特征并用于精准医学。

一种单独的信息驱动方法绕过了对无目标发现实验的需求，缩短了方法开发时间。所有实验都是在QqQ-MS方法上进行的，目标是在感兴趣的疾病领域中发表的文献中报道的代谢物生物标志物候选物，并导入SRM过渡信息。例如，对肾脏疾病生物标志物感兴趣的实验室可以建立一种针对尿毒症毒素的方法。现有的碰撞能量（CE）转换方程可以用于转换不同供应商仪器上的报告数据。样品的几次重复进样用于绘制目标代谢物保留时间，以完成计划/定时的SRM参数。

虽然信息驱动的方法试图验证先前建立的候选生物标志物，但QqQ-MS在综合分析应用中也非常强大，其目标是识别临床条件/亚群与代谢物水平之间的新关系（即精准医学）。随着QqQ-MS技术的不断发展，获取高质量SRM数据所需的有效停留时间不断减少（例如，100毫秒降至5毫秒），因此可以在一次LC-MS运行中自信地量化数百种代谢物。重要的是，多个团队最近的工作已经确定，已知代谢组的大小在目标分析方法的范围内。非靶向代谢组学研究报告的数万种代谢产物特征是对观察到的实际代谢产物数量的粗略膨胀。Mahieu等人的一项研究可能最能证明这一点。在本例中，他们对具有25000个特征的代谢组学数据集进行了严格检查，确定大多数特征是同位素、加合物、人工产物或污染物，并且独特代谢产物的实际数量不到1000。同样，我们自己对人类代谢组数据库（HMDB）的分析，重点是在人类血浆和/或尿液中检测和定量的内源性代谢产物，共发现1200种代谢产物。其中36%是脂质，剩下大约750种极性代谢产物。对这750种代谢物的深入评估告诉我们，不可忽略的比例与ESI的电离不良，并且一些亚组需要专门的方法来优化解决（例如，糖）。因此，使用QqQ-MS结合几种分离模式（例如HILIC和RPLC）进行综合代谢组分析是可行的。

三

构建Metabolite SRM面板

由于QqQ质谱仪提供了基本上有针对性的工作流程，因此在仪器方法中需要考虑有关代谢物的具体信息，则需要考虑单个SRM、CE值和保留时间（RT）。SRM跃迁包含前体和产物离子的m/z，CE是前体碎裂的电压偏移。通常，使用相同代谢物的第二个、有时是第三个SRM来提高测量的灵敏度和特异性。代谢物SRM信号强度的比值是代谢物特异性的，可用于确认峰值的注释（图2）。因此，我们对小组中几乎所有代谢物的两种SRM进行了监测，其中一种用作定量代谢组学应用中的量词，另一种用作定量范围。

有多种方法可以建立SRM、CE和RT。一种方法是使用每种目标物的对照品。可供使用的代谢物标准的广度正在不断扩大，既有较大的消耗品供应商，如剑桥同位素实验室股份有限公司（CIL），也有较小的专业公司，如MetaSci（MetaSci.ca）。整个代谢物标准库，如IROA的质谱代谢物标准库（MSMLS），也可商购。使用这些MSMLS试剂盒中的一种（例如，用于微生物组），未标记的标准品可以单独或以自配混合物的形式输注，以确定最佳SRM和CE，然后注射到LC-MS平台上进行RT测定。虽然使用真实的标准品是获得这些必要方法参数的最直接方法，但这样做可能耗时且耗费人力。此外，某些感兴趣的代谢物的标准品，特别是其稳定同位素标记形式的代谢物，可能无法在商业上获得，或者可能成本高昂。

图2：监测每种代谢物的多个片段（如本文所示的马尿酸）可以增加注释的可信度。此外，SRM的相对峰面积是代谢物特异性的，大的偏差可能表明测量不可靠。有关SRM比率接受标准的指导，请参阅世界反兴奋剂机构技术文件TD2021IDCR。

建立靶向方法参数的另一种方法包括将非靶向HRAM质谱仪上获得的信息转移到QqQ，如Schwaiger Haber等人的工作所示。简言之，作者使用Orbitrap ID-X质谱仪来识别感兴趣的代谢物，然后将这些信息用于多个供应商QqQ质谱仪（包括TSQ Altis）上的方法创建，以进行后续确认。来自Orbitrap ID-X质谱仪的代谢物碎片数据用于确定SRM转变，而最佳CE是使用基于在两种类型的仪器上分析的一组已知代谢物的转换方程来建立的。由于LC方法在仪器之间是相同的，代谢物RT可以直接转移。在一项人类血浆图谱研究中，对100种已知和未知代谢物证明了这一方法的实用性。重要的是要记住，目标LC-MS方法的改进可能是消除代谢物干扰所必需的，因此仔细检查SRM数据对于最终在临床驱动的MS代谢组学应用中提供准确的定量至关重要.

最后，许多代谢物SRM可以从文献、供应商和公开资源中获得。例如，许多出版物在其补充信息中报告了代谢物SRM参数。CIL提供了与SRM相关的其组学试剂盒的用户手册中的参数，如其U-13C和未标记的代谢物和脂质酵母提取物产品的情况（代谢物：目录号ISO1和ISO1-UNL；脂质：目录号L-ISO1和L-ISO1-UNL）。赛默飞科技mzCloud™高级质谱数据库（mzCloud.org）也非常有用。mzCloud数据库是一个手动策划的数据库，包含30000多种化合物的MS片段树。该数据库包含这些化合物的200多万个碎片光谱，这些信息可用于筛选最有前景的SRM，以在QqQ质谱仪上进行确认。由于该数据库中的许多片段离子都用化学结构进行了注释，因此可以容易地确定13C标记的产物离子的m/z。这种方法的主要局限性是代谢物RT通常是未知的。此外，最佳CE是特定于仪器的，不能直接从备用供应商转移到QqQ。为了解决这一问题，可以通过对含有感兴趣的代谢物的样品进行侦察实验来建立RT，只有当单个化合物产生显示多个峰的非唯一SRM时，才能获得标准进行结论性注释。类似的侦察方法可用于识别仪器特定的最佳CE。为了帮助实现这一点，目标MS处理软件的开发人员，如Skyline，已经包含了CE优化的功能。

四

稳定同位素标记标准的重要性、设计和实施

为了促进代谢组学中基于MS的准确测量，以及跨批次和实验室的标准化，必须纳入稳定同位素标记的标准品。理想的方法是将精确量的标记标准品添加到实验和QC（例如，混合基质，见下文）样品中，以发挥IS的作用。这有助于研究人员评估基质效应和提取效率。只有添加IS，才能有效评估和规范样品、批次和仪器平台内部和之间的回收差异。对于IS的使用，类型及其插入点是研究人员在设计分析稳健的代谢组学方法时面临的两个关键因素。这对于评估化验的有效性以及在必要时帮助指导纠正措施至关重要。

IS的性质可以采取多种形式，但通常是用一种或多种稳定同位素（通常为13C、15N和/或D）标记的化合物或化合物混合物。在研究设计中必须仔细选择标记类型，因为它可能会受到所使用的预分析和分析方法的影响。例如，如果选择了D-标记（如新生儿筛查测试中的典型情况），则必须将标记插入不可更换的位置，以减轻氢-氘交换的影响。与氘相比，用13C（和/或15N）标记通常是优选的，因为它的化学稳定性有助于确保同位素在整个实验方法中保持完整。换言之，13C（和15N）同位素在分析工作流程的所有阶段（从基质尖峰到分析）都保持在其合成点。这为研究人员提供了灵活性，因为制备策略的选择和MS/MS分析模式都没有限制。由于13C（和/或15N）标准品具有特殊的同位素稳定性，因此可以在样品制备的早期阶段插入这些标准品。额外的好处是，这种类型的标记化合物在色谱分离过程中与其相应的未标记代谢物（在特定基质中）共稀释。这种共洗脱行为在校正离子抑制和基质效应方面是最佳的。此外，13C（和/或15N）标准不受质谱仪中电离和碰撞激活过程中同位素扰频或损失的影响。由于这些共同优点，13C（和/或15N）标准已被证明在MS应用中具有巨大价值，应被视为研究人员研究设计过程中的首选标准。

无论所选择的同位素类型如何，代谢组学中标记的标准物理想情况下都应与其未标记的对应物相比具有Da的最小质量偏移。与位置标记相比，均匀标记更受青睐，因为它在标记到未标记的质谱分析中为前体和/或产物离子的分化提供了更大的机会。这在SRM过渡选择中尤其有益，如使用QqQ质谱仪时的情况。在使用之前，同位素标记的标准品必须具有良好的特征（在化学和/或手性纯度和同位素富集方面），以便能够准确地计算方法应用中的损失或错误。这与人为（如移液）、化学（如分析物提取、水解）和/或仪器（如离子抑制、基质效应）错误有关。为了在应用中获得最佳结果，应尽可能早地在分析工作流程中添加标准，以便它们能够有效地规范整个实验阶段可能出现的变化（图3）。

就要实施的标记标准的数量而言，建议IS的数量等于用户目标面板中分析物的数量。虽然这通常适用于小型面板，但当使用大型面板时，它会变得极其劳动密集且成本高昂，如本文所述的代谢组学方法。在这些情况下，一种合适的方法是使用一组较小的稳定同位素标记的IS，该IS仍然代表所测代谢物组的化学多样性。这些标记的标准可作为未标记对应标准的直接IS。此外，它们可以作为那些缺乏直接标记类似物的代谢物的“替代”标准。这种做法在量化练习中被认为是可接受的，前提是替代物表现出与内源性样品中的天然靶标相似的洗脱时间，从而具有相似的物理化学性质。

市售的U-13C代谢物酵母提取物（CIL目录编号ISO1）提供了高同位素富集度（纵向HRMS分析定义≥98%）的均匀标记13C代谢物的稳定来源。存在的100种生物相关代谢产物跨越广泛的代谢类别（例如，氨基酸和有机酸、糖磷酸盐、辅酶）、生物化学途径（例如，柠檬酸盐和乙醛酸循环、氨基酸和核苷酸代谢、磷酸戊糖）和细胞/分子过程（例如，免疫系统、凝血、DNA代谢）。由于酵母是真核生物，其代谢产物组成在人类代谢组中很大程度上是保守的，这使得这种材料成为人类定向研究中标记IS的一个非常适合和可接受的来源。除了其优点之外，高浓缩提取物还通过各种分析方法进行了表征和验证，这增强了其在MS代谢组学（从基础研究到临床翻译）中的实施和标准化。在实验应用中，可以在分析工作流程的早期添加溶解的U-13C代谢产物酵母提取物的等分试样，作为其内源性类似物的有效IS。这些IS也可以作为给定样本（如人类尿液）中缺乏直接IS的内源性代谢物的潜在替代品。这提供了一种有用的方法，可以使用单一的、一致制备的产品来源，在一次运行中最大限度地量化分析物的数量。

图3。样品制备和LC-MS程序。尽早（即在样品提取和LC-MS分析之前）将U-13C-内标混合物（例如，CIL的代谢物酵母提取物目录编号ISO1）掺入每个研究样品中，以纠正样品分析过程中引入的错误。

五

大规模代谢物库的QqQ-MS优化

为了最大限度地提高LC-MS方法的分析性能，必须仔细优化液相色谱的性能。最大化沿梯度分布的峰容量提供了显著的好处，包括更高的灵敏度、减少的离子抑制，以及分离异构化合物（如亮氨酸和异亮氨酸）所产生的增加特异性的潜力。此外，具有高再现性的窄色谱峰形状能够实现更严格的计划窗口，这可以减少在给定时间窗口中监测的并发SRM转变的数量。从历史上看，反相液相色谱（RPLC）一直是代谢组学研究的首选方法。这种分离模式适用于代谢组的中极性至非极性片段，但不能很好地保留或分离极性代谢产物。这可以通过使用代谢物离子配对或衍生试剂来解决。最近，亲水性相互作用液相色谱（HILIC）分离技术的成熟使其成为RPLC的可行替代品，其优点是极性代谢物可以在不需要离子配对或衍生化的情况下保留和分离。由于我们研究的主要重点是更极性的代谢物，我们为一组极性代谢物开发了一种快速而稳健的基于HILIC的MS方法，该方法可以基线解析异构代谢物（图4）。在该实验工作流程中，使用U-13C代谢物酵母提取物的代谢物作为IS，实现了注释和定量的置信度提高。

将一流的QqQ质谱仪与提供UHPLC分离的液相色谱系统相耦合，对于处理增加的峰值容量来说是必不可少的。靶向代谢物的100s及其相应的13C-标记的IS仍然可以导致大量并发的SRM转变，尽管使用了窄的RT窗口调度。定量方法的目标是确保每个LC峰值宽度至少有7到10个数据点用于峰值分析。因此，必须通过指定数据点的数量和平均LC峰值宽度来确定循环时间。根据这两个用户定义的参数，为给定时间表窗口中的所有SRM转换确定等效停留时间设置，从而最大限度地减少开发中所需的前期工作。

图4。使用我们的色谱法可以分离的异构体对的两个例子。柱：Atlantis Premier BEH Z-HILIC（2.1×150 mm，1.7µm颗粒），H2O-ACN梯度与乙酸铵（pH 7）。（A） SRM:132.2→86.2（12C），138→90.9（13C），（B）SRM:153.2→109（12C，SRM1），153.2→107.9（12C，SRM2）。注意，SRM1对2-焦儿茶酸的强度高于SRM2，对龙胆酸的强度反之亦然。

TSQ-Altis质谱仪有一个额外的软件工具，可以简化停留时间设置的方法改进。停留时间优先级（DTP）设置为用户引入了一个优先级选项，通过手动更改优先级，可以自动更改每次SRM转换的停留时间。在使用上述过程创建初始方法时，每个SRM转换都具有（正常）的DTP设置，以获取初始测试数据集。在处理之后，具有较低强度/面积值和/或变异系数（%CV）的那些SRM转变可以从DTP设置3改变为2或1，从而增加优先级。同样，对于具有极其丰富信号的SRM，DTP可以从3降低到4，甚至5。板载处理器将计划时间窗口中DTP设置较低的所有其他SRM转换的停留时间提供给DTP设置较高的SRM转换。相反，它最大限度地减少了在丰富信号上花费的时间，为具有更高优先级DTP的转换提供了更多的时间。总体响应是改善低水平SRM测量，而在赛默飞科学TSQ Altis质谱仪、赛默飞科学TS Q Altis MD系列质谱仪和赛默飞科学TSQ Altis Plus质谱仪上使用较短停留时间测量的更丰富的SRM跃迁可以保持可接受的定量再现性（图5）。

图5。保留时间调度和停留时间优先级（DTP）。（A） LC-MS运行期间每个测量周期内的SRM（转换）数量（总共600个SRM和1分钟的调度窗口）。（B） 过渡“负载”（循环中并发SRM的数量）对停留时间的影响。每个周期的SRM越多，停留时间就越低（基于基准处12 s的峰值宽度和每个峰值10个数据点）。（C） DTP后的停留时间。这提高了低丰度SRM的测量质量。

六

数据质量控制和规范化

确保高数据质量对于准确的解释和决策至关重要。特别需要考虑三个要素：

1.确认LC-MS性能在规范范围内；

2.监测运行过程中的数据质量，以检测分析问题，并查看是否需要进行信号校正，从而可以将运行中的样本相互比较；

3.能够比较不同LC-MS批次的数据，这对于分析大型临床数据集很重要

这些元素中的每一种都可以用每个LC-MS批次中应包含的特定样品进行评估：

1.系统适用性样本——这通常是一个定义明确的样本，含有一小部分稳定的代谢物，例如CIL的QReSS质量控制混合物（目录号MSK-QReSS-KIT）中存在的代谢物。使用系统适用性样本有助于将运行与来自同一样本的历史数据进行直接比较，以确定LC（例如，保留时间、峰值形状和宽度、背压）和MS（例如，信号强度、S/N、质量精度）性能。Skyline的AutoQC等应用程序提供现成的解决方案，将最近运行的系统适用性与之前的分析进行比较，从而能够立即评估系统的趋势性能和技术问题的识别。

2.QC样本——这通常是该批次研究样本的合并样本，理想情况下加入同位素标记的代谢物混合物（例如，CIL的QReSS混合物），每8-10个研究样本后进行一次。主要使用混合QC样品的优势在于，它能够评估所研究的每种代谢物的保留时间和信号稳定性（图6）。对于大批量，在运行过程中观察到一些信号损失并不罕见，QC样本数据可用于有效应用信号校正算法。还建议在运行开始时运行QC样品稀释系列，例如未稀释、2倍稀释、4倍稀释和8倍稀释。这有助于确认正在研究的代谢物的线性反应。

3.参考样品——在每批中至少运行一次的样品。该样本的数据可以作为“参考”，以评估不同批次数据中存在的显著差异，从而确定是否需要进行批次校正。理想情况下，该样品具有与研究样品非常相似的成分，并且可以是生物样品。最好制备许多等分样品，并将其储存在尽可能冷的地方（≤-80°C），以最大限度地减少冻融循环和代谢物降解。值得注意的是，使用稳定的同位素标记IS将减轻批量校正的需要。

图6。使用标记标准作为IS的250+尿液样本集的保留时间和峰值面积的稳健性。所有尿液样本的合并样本用作质量控制（QC）样本，并在研究开始时和每10个研究样本后注射。（A） 代表性代谢物的第一次和最后一次QC样品注射之间的保留时间偏移，具有早期、中期和晚期保留时间。SRMs显示，苯基丙酮酸：163→91（12C），172→98（13C），瓜氨酸：176→159（12C），182→165（13C），赖氨酸：147→84（12C），153→89（13C）。（B） 第一次和最后一次QC注射之间单个代谢物的峰面积变化，以及（C）峰面积%CV的分布。

采集后数据归一化通常在代谢组学研究中进行，用于消除样品制备和LC-MS分析过程中引入的样品间变异性。此外，标准化还可以校正临床样本之间总代谢产物丰度的差异。例如，尿液中的总代谢产物水平因供体的水合状态而异，在对样本进行有意义的比较之前，这需要在前（样本浓度调整）或后（标准化）分析中进行校正。存在各种标准化程序，这一点在其他地方已经得到了有效的审查。一种流行的程序是中值标准化，其中，对于每个LC-MS运行，确定代谢物的中值峰面积，并将该运行中的所有代谢物峰面积表示为与中值峰面积的比率（标准化）。这种方法的主要缺点是，样本中的所有代谢物都受到相同的归一化因子的影响，而这些代谢物可能会经历截然不同的基质效应，从而引入误差并降低归一化的有效性。因此，我们尝试使用代谢物与稳定同位素标记的IS的比值进行中值归一化，而不是仅使用内源性代谢物峰面积（图7）。由于稳定同位素标记的标准品经历与其内源性代谢物相同的基质效应，因此它们的比率不受离子抑制效应的影响，因此使用比率的归一化应能减少误差。事实上，我们发现代谢物与IS比率的归一化优于标准归一化方法（图8）。

图7。13C代谢物标准比率的使用提高了标准化。标准中值归一化程序和使用代谢物/13C标记的内标比率的中值归一化。比率的中值归一化消除了由于矩阵效应引起的误差。

图8。无（红色）和有（蓝色）内标比率的中值归一化质量。通过LC-MS分析商业合并尿液的稀释系列（1×，2×，4×稀释），将等量的U-13C-标记的酵母代谢产物提取物刺入每个样品中。使用图7的程序对数据进行归一化。该图显示了样品稀释度之间单个代谢物的残余倍数差异。使用13C标记的标准比率，残余差异要小得多。

七

结  论

代谢组学的兴起为研究一组分子提供了一条很有前途的途径，这些分子可以实时读出受试者的遗传、微生物组、生活方式和环境暴露的综合影响。因此，它有望为药物开发和诊断提供新的生物标志物，从而成为多组学努力的重要组成部分，为精准医学赋能。要真正实现代谢组学的潜力，需要多种分析方法。除了旨在识别新的代谢物生物标志物和表征未知物的基于HRAM MS的方法外，还越来越需要有针对性的方法来实现对大样本集、批次和实验室代谢物特征的标准化/定量分析。如本白皮书所述，具有稳定同位素标记标准的QqQ MS方法能够很好地满足这一持续需求。