总RNA,经寡聚(d丁)纤维素亲和层析柱分离出mRNA,以寡聚(d丁)为引物,经反转录合成双链cDNA。先用反转录酶合成第一条cDNA链;经碱降解作用除去RNA模板后用大肠杆菌DNA聚合酶,以第一条链cDNA的3’末端结构为引物合成第二链,最后形成双链cDNA。
Promega公司的RibocloneR M-MLV(H -) cDNA合成系统采用M-MLV反转录酶的RNase H缺失突变株取代AMV反转录酶,使合成的cDNA更长。该系统的第一链合成使用M-MLV反转录酶,cDNA第二链合成采用置换合成法,采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ进行置换合成,最后用T4 DNA聚合酶切去单链末端,方法简便易行。
长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子,它们并不编码蛋白,而是以RNA的形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达水平。
包装细胞293T细胞的培养
RIP技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀),是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术,是了解转录后调控网络动态过程的有力工具,能帮助我们发现miRNA的调节靶点。