基本信息

论文题目：Mutation in OsCADT1 enhances cadmium tolerance and enriches selenium in rice grain

发表期刊：New Phytologist

影响因子：7.299

作者单位：南京农业大学

本文涉及的高通量技术: 全基因组重亚硫酸盐测序（Whole genome bisulfite sequencing, WGBS）由欧易生物提供

 

研究背景

镉（Cd）是毒性最强的重金属之一，广泛分布于环境中。植物可吸收土壤中的镉，成为食品安全和人类健康的威胁因素。植物源的食物（特别是谷物类）是人体镉暴露的主要来源。镉污染可通过影响多种生理生化过程抑制植物的生长和发育，例如光合作用、水平衡、多种酶的激活、氧化应激的产生和体内基因的表达。植物目前已经进化出一些镉减毒机制，其中最重要的是以谷胱甘肽（GSH）为底物合成植物螯合肽（PCs）来响应镉暴露。PCs作为硫醇富集的多肽，可以同镉形成复合物（PC-Cd）进而减少细胞中游离的Cd2+。水稻PC合成酶（PCS1）突变后，镉敏感性提高，而抑制GSH的合成也有同样的效果。水稻OsCLT1转运蛋白可调节PCs合成所需底物的转运，基因突变后可导致对砷和镉的高敏感性。诸多前期研究表明镉耐受同硫营养素之间有很强的联系。

 

研究内容

目前关于水稻中镉耐受的机制还有许多未知。作者在（EMS）诱导的籼稻中利用根生长实验，分选出了一种镉耐受提高的变种：cadt1。通过基因组重测序以及互补比对，作者最终鉴定出造成这种表型变化的突变基因，OsCADT1。检测发现OsCADT1蛋白定位于细胞核中，于根和芽中表达。OsCADT1突变后，芽和谷粒中的硫和硒积累，硫酸盐的转运蛋白OsSULTR1;1以及缺硫诱导基因OsSDI1表达升高。这些结果表明，OsCADT1抑制硫酸盐吸收和同化，当其突变后会引起镉耐受的增强以及水稻颗粒中的硒含量，为硒的生物强化提供了一种新的思路。

 

研究思路

 

 

 

研究结果

1．突变体的筛选及镉吸收检测

EMS诱变的中嘉早17经过筛选后，发现了一个镉耐受突变体，cadt1。无镉处理时，cadt1 组和WT组间根延伸无明显差异，用2 μM 镉处理后，cadt1组根延伸受到的抑制显著低于WT组（图1a）。剂量实验也显示cadt1 组有较好的镉耐受（图1b）。基于镉中毒往往会产生活性氧，作者随后检测在2 μM 镉处理条件下两组植株根中的H2O2，结果显示cadt1 组根中的H2O2明显少于WT组（图1c）。

在获得突变株后，作者随即验证该突变体是否通过降低镉吸收增强了镉抵抗。在镉处理的条件下，cadt1 组根中的镉浓度超过WT组1倍（P<0.001），在芽中两组无明显差异（图1d）。而大田种植的水稻中，两组水稻颗粒中的镉浓度也无明显差异（图1e）。说明cadt1 组不是通过减少吸收来增强镉抵抗的。

 

图 1｜水稻cadt1 突变体的表型

 

2．cadt1 突变体合成了更多的硫醇复合物，例如PCs

在排除了镉吸收减少的可能性后，作者随即尝试检测了通过螯合作用在镉的解毒过程中有重要作用的硫醇复合物。结果显示镉处理后甘氨酸、PC2、PC3在cadt1 组的根中明显增加、但在芽中无明显变化（图2a, b）。GSH在根和芽中都没有明显的变化，同时PCS基因的表达也未发生显著变化，暗示镉可能不是通过增加PCS的转录而是通过形成GSH-Cd复合物来增加PCs合成。

 

图 2｜镉处理下WT组和cadt1 变异体组水稻根部硫醇化合物的浓度

 

3．cadt1 突变体积累了更多的硫酸盐

因为巯基化合物都是包含硫的代谢物，作者随后检测了cadt1 组和WT组的硫浓度（0.45 mM硫酸盐，水培）。结果显示在芽中，cadt1 突变体芽、木质部汁液中的硫浓度显著升高（见图3a-c）。大田实验中，cadt1 组的秸秆和谷粒中的硫浓度均明显高于WT组（见图3d），同时其他营养素基本无明显变化。

 

图 3｜cadt1 突变体在芽中积累了更多的硫酸盐

考虑到会通过硫酸盐的通路被植物吸收和同化，作者随后检测了cadt1 组和WT组中的硒浓度（1 μM，水培）。结果显示在cadt1 中突变体芽中的硒浓度显著升高（见图3e）。大田实验中，cadt1 组的谷粒中的硒浓度均显著高于WT组（见图3f）。短期实验显示，在两组中根部的涌入和溶液中盐浓度呈现双曲线关系（见图3g）。

 

4．关键基因OsCADT1 的克隆

在进一步探索突变体性状改变的分子机制前，作者检测了cadt1 组和WT组的生物量以及农业相关特性，结果发现3处实验田中2处的产量、株高等无明显差异，最后1处产量减少了20%。作者随后挑选cadt1 突变体回交后的F2代（性状分离比接近3:1，见图4a）中突变体表型的植株和WT组进行重测序检测，发现假定的丝氨酸羟甲基转移酶基因OsCADT1 上1号外显子区域上的一个突变：T451C（L154P）同表型相关，并用一代测序和dCAPS技术分别验证（见图4b-e）。回补实验证明，当突变体中敲入正常的OsCADT1 基因时，相关表型倾向表现WT组特点（见图4f-h）。

 

图 4｜水稻中OsCADT1 基因的克隆

在确认OsCADT1 是突变体表型变化的主要基因后，作者检测了该基因的表达特征。结果显示其表达类似于拟南芥中的同源基因MSA1，即位于细胞核中（见图5a），在叶片薄壁组织和根上皮中显著高表达（见图5b-e）。qRT-PCR显示根中的表达超过芽，特别是在硫饥饿条件下（见图5f）。

 

图 5｜水稻中OsCADT1 基因的表达特点

 

5．OsSULTR1;1 和OsSDI1 基因在cadt1 突变体的根中表达上升

因为OsCADT1 突变会引起突变体芽中硫含量和硫酸盐浓度的升高，作者随后进行了转录组测序以探究硫酸盐吸收和同化相关基因的变化情况。最终作者发现在正常硫供给的情况下，OsSULTR1;1 在突变体根中表达显著上升，同时验证吻合。在硫缺少时，突变体中的表达上升幅度更为明显（图6b）。另一个同小麦中硫酸盐缺乏诱导基因SDI1 高度同源的OsSDI1 也有类似的表达特点（图6c）。

 

图 6｜水稻中OsSULTR1;1 和OsSDI1 的表达情况

因为OsCADT1 的同源基因MSA1 在突变后引起了几个硫酸盐转运和硫缺乏应激基因的低甲基化，且MSA1 可能同细胞核内SAM浓度有关。作者利用WGBS技术检测OsCADT1 突变后对甲基化的影响。结果显示OsSULTR1;1 基因发生了gene body和3’UTR区显著的甲基化水平变化。OsSDI1 则是在启动子和编码区有显著变化（见图7）。作者推断甲基化的变化很有可能是引起表达显著变化的原因。

 

图 7｜水稻中OsSULTR1;1 和OsSDI1 的甲基化状态改变

 

6．cadt1 突变体改变了甘氨酸、丝氨酸的浓度以及硫相关代谢

在硫充足的条件下，cadt1 突变体组相对WT组在根中的甘氨酸浓度有所上升，不过丝氨酸在根和芽中的浓度变化呈现相反趋势（见图8a，b）。相对于WT组，突变体组的OAS在根和芽中均无明显变化（见图8c），与之相反的是在根和芽中，甘氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、同型半胱氨酸的浓度显著升高（见图8d-g）。突变体组的根部甲硫氨酸积累明显低于WT组，芽中则无明显的差别（见图8h）。

考虑到甲硫氨酸是甲基基团供体SAM的前体，作者随后测定了SAM和SAH的浓度，两者在突变体组芽中的浓度均明显高于WT组。而在根中，SAM和SAH浓度相对WT组下降（见图8i，j）。

 

图 8｜cadt1 突变体改变了甘氨酸、丝氨酸的水平以及硫相关代谢物的浓度

 

2020年与欧易生物合作的科学家们已经开始发文啦！希望，欧易生物为各位老师解读的本篇文献对计划做类似项目的老师有所帮助。再次恭喜南京农业大学合作科学家团队！最后，欢迎各位老师来电与我们探讨更多测序问题哟~（技术热线：021-34781616）

 

参考文献

Jie Chen, Xin-Yuan Huang, David E. Salt, Fang-Jie Zhao. Mutation in OsCADT1 enhances cadmium tolerance and enriches selenium in rice grain. New Phytologist. , 2019 Dec 26. doi: 10.1111/nph;

 

# END #

本文系欧易生物原创

转载请注明本文转自欧易生物

领域：基因/基因组/测序