快速有效的病毒检测在限制群体病毒传播上是非常关键的，COVID-19 疫情期间对病毒检测的突发需求，突显出现代医学一个巨大的挑战。根特大学（Ghent University）的研究人员正在开始开发一种基于团体努力为COVID-19 检测建立的基于质谱的分析方法，为监控通过人群的传播的新型冠状病毒SARS-CoV-2 病原体提供了一个可供选择的方案。

高效的人群检测，对主动监控诸如SARS-CoV-2 这样的病原体的传播是非常重要的，在降低传播方面提供了定量数据来支持决策者。根据全国新冠病毒核酸检测信息平台数据，截至2022年5月11日，全国新冠病毒核酸检测总检测能力每日近5700万管。在疫情开始的时候，COVID-19 几乎毫无例外地使用逆转录聚合酶链式扩增反应（RT-PCR）方法来检测，但是单纯依赖一种技术是有明显劣势的。这种在世界范围对RT-PCR 方法前所未有的需求，导致检测和其他必要试剂的长期短缺，限制了检测容量。为了缓解实验室的压力，我们意识到对于像RT-PCR 这样有效且通用的一个全新方法的需求。因使用不同的试剂和工作流程，质谱方法完全垂直于其他核酸检测方法，具有快速有效的病毒检测，在限制群体病毒传播上是非常关键的， 可以在非常短的时间框内将检测容量提升一倍的潜力。

尽管RT-PCR这样的技术检测效率高、相对简单、价格低廉，单纯依赖一种技术的检测结果，在灵敏度、假阳性和假阴性诊断方面难以互相验证。此外，对病毒核酸本身检测，不能用来直接定义病毒脱落或感染潜力，这突显出检测病毒其他生物分子的重要性。与许多其他病毒一样，SARS-CoV-2可以产生含有高浓度的病毒样颗粒(VLPs)，这使得VLPs成为基于液相色谱质谱(LC-MS)的检测和表征的非常有吸引力的研究目标。实际上，基于质谱的蛋白质检测与传统的临床小分子检测可兼容，并可在几个小时内适应新的病毒突变。此外，由于质谱检测没有扩增步骤，比基于RT-PCR的方法更不易受到污染。

基于SWATH采集策略,

寻找SARS-CoV-2特征生物标志物 

根特大学（Ghent University）研究人员建立了一个可供选择的质谱检测方法，它能识别COVID-19 感染来源的结构蛋白酶解物，并且由其他实验室的人员评估了该方法应用的有效性和可靠性。

研究人员基于SWATH® 采集(DIA, 一种SCIEX 的非数据依赖型采集方法)策略，使用靶向in sillico 预测谱库的在非模式生物中寻找新的生物标志物肽段方法，该方法可以提供宽的分析范围、特异性和重复性。在SCIEX TripleTOF™ 6600+ 系统上采用SWATH® 采集方法，利用重组核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N蛋白）和刺突蛋白（Spike protein，S蛋白）(中国生物科技有限公司，北京，中国)，结合20例患者的鼻咽棉签样本，应用最近发布的数据采集和数据分析工作流程机器学习（Machine Learning）训练预测谱库，以这种方式发现识别17 个肽段生物标志物。

图2. 发现阶段(蓝色，图片引用自pubs.acs.org/jacsau.) (A) 17个SARS-CoV-2特征肽段生物标志物。根据公开报道数据，我们选择了两个靶蛋白(NCAP_SARS2和SPIKE_SARS2)，并获得了重组的等效蛋白(义翘神州/Sino Biological)。一系列健康志愿者鼻咽拭子250 μL 通用运送培养基稀释作为本底背景，利用最近发表的工作流程，结合窄窗口数据非依赖型采集（DIA）与预测强度和保留时间，对17个特征肽段进行检测。箭头表示重组蛋白序列中的一个取代氨基酸。加粗体序列由最近Grossegesse等人的综述和参考文献报道。下划线序列分别映射到刺突蛋白（SPIKE_SARS2 (S)）、核衣壳蛋白（NCAP_SARS2） C 端结构域和核衣壳蛋白（NCAP_SARS2 ）RNA结合结构域（从左至右）。被映射的肽段在立体结构上被突出显示，保守性评分标成红色(0%保守)到蓝色(100%保守)。黑色字体序列表示SARS-CoV病毒的唯一序列。

SWATH 采集数据的优势，

可以使这些信息简单快速转化成

三重四极杆设备的多反应检测（MRM）方法

这个最初的MRM检测方案迅速开发出来，并且可以正确地对所有20个盲样患者样本进行分类。获得的质谱数据强度和PCR 方法中获得的Ct 值具有很强的线性相关性，这初步结果鼓励研究人员将研究进入下一阶段，验证这个检测是否可以转移到其他仪器。

图2. 发现阶段(蓝色，图片引用自pubs.acs.org/jacsau.) (B)基质干扰和肽段选择。不管肽段的进化保守性如何，所有候选肽段都被保留，进行与基质效应、实验条件或液质仪器兼容的稳健分析方法的开发。根据样品保存缓冲液的不同，信号强度和干扰会有很大的变化，如图所示，在没有(in-solution)和有样品保存液eSwab和UTM背景的情况下，保留时间2.5 min时AYNVTQAFGR和DQVILLINK的MRM离子对信号。箭头表示正确的峰值。虚线内的信号，即，将峰面积相加，计算LogSumAUC值。

图2. 发现阶段(蓝色，图片引用自pubs.acs.org/jacsau.)  (C)三种不同样品保存液背景的强度/载样量相关性。重组蛋白用于在无基质(in-solution，n = 1)或eSwab(生理盐水基质，n = 1)或UTM(蛋白基质，n = 3)( 相当于5 μL培养基的柱上量)中评估载样量。左侧嵌入图说明了保存样本溶液背景对低强度信号的影响。右侧嵌入图强调了仪器检测限(LOD)和潜在定量限(LOQ)，和这些病毒蛋白在溶液中的所有MRM离子对儿强度的总和。

图2. 发现阶段(蓝色，图片引用自pubs.acs.org/jacsau.)  (D) 质谱蛋白信号与RT-PCR RNA检测的相关性。从Skyline文件开始，通过MRM离子对选择，开发了UTM样品的MRM分析方法。最终的方法由总共包含30个MRM离子对的10个肽段组成。我们对从鲁汶大学(Leuven)医院获得的20个患者UTM样本进行了MRM分析。相当于5 μL的培养基样本的柱上量 (每份样品3 mL)。利用Skyline软件进行检测结果报告，对所有肽段的总AUC (LogSumAUC值)进行对数变换。当与RT-PCR测量的Ct值作图时，发现有强相关性（可以通过公式将Ct值转换为预期的质谱信号强度），这表明该质谱检测方法在临床上有很大的应用潜力。阴性患者(红色)的LogSumAUC值都超过X轴上垂直双线(Ct >40)。

领域：细胞生物学,蛋白/抗体/蛋白质组,基因/基因组/测序