生物药品活性成分常用检测方法及局限性

随着生物药品的迅速发展，研究人员将面临的一项挑战任务是开发一种可靠、耐用和高效的检测方法，以在体外和体内检测和量化有效的生物药品成分。

最常用的方法包括经典配体结合测定(LBAS)、LC-MS的测定，以及新出现的LBA-LC-MS混合技术。LC-MS和LBA-LC-MS是一个技术先进的方法，但是操作复杂，周期长，通量低，成本高，不适合于快速筛选和早期开发研究大样本量的实际需求。

对于LBAS而言，ELISA是最常用的用于定量目的的方法。虽然在技术上要求较低并且成本低，但它高度特异性的抗体对，但是新的重组肽或蛋白质通常是不容易拿到高质量的抗体对。筛选可用的抗体对是耗时和费力的，涉及昂贵的纯化步骤，并且依赖于使用的动物。另外，抗体可能无法检测所有重组蛋白质构建体变体。

另一种常见的LBA是传统的Western印迹法，但是无法准确定量，操作繁琐，不稳定，不符合生物药品准确性，耐用性和稳定性的要求。

基于Wes建立生物药品活性成分检测方法

（体外稳定性实验和体内药物代谢动力学）

俄亥俄州立大学药学院的科学家，基于ProteinSimple的Wes定量Western blot技术开发了一种新的，高效，高灵敏度的定量工具，以支持治疗性重组蛋白的早期开发，避免上述限制。

An efficient and quantitative assay for epitope-tagged therapeutic protein development with a capillary western system，Bioanalysis，Published online:20 March 2019。

简述：本研究使用的重组蛋白，分子量约为55kDa，N端6X-His-标记，C末端DYKDDDDK(FLAG)。抗体：生物素化的抗Flag抗体，链霉亲和素-HRP。Wes单次可以检测25个样品，在从样品处理开始到数据采集的6小时内（Wes操作及检测时间约为3.5小时).

LLOQ为0.4nM(20ng/mL)。作者基于该平台完成了一个方法开发快，高效的，检测速度快的重组蛋白类药物的体外稳定性研究和药代动力学（PK）研究的技术平台，且无需产生特异性单克隆抗体。该方法也消除了目标蛋白富集步骤，富集可能引入显著的样本间变异性。

Wes自动化的免疫测定平台，基于毛细管电泳技术，整合了免疫学检测方法。

在生物制药领域具有一系列独特优势

1. 全程自动化

2. 精密度高

3. 耐用性好

4. 灵敏度高

5. 准确定量

部分结果

精密度

体外稳定性实验

体内药物代谢动力学（PK）实验

作者文章总结• Development and validation of a reliable, robust and efficient assay to detect and quantifymacromolecules in vitro and in vivo during the early stage of a biotherapeutic agent discovery remain a major challenge for researchers, especially in the academia setting where resources can be limited.• A simple (enrichment-free), highly sensitive and efficient immunoassay using a capillary-based western system to assess the in vitro stability and pharmacokinetic properties of propitious epitope-tagged recombinant proteins in vivo in mouse to support an early stage development of a lead therapeutic recombinant protein.• The method validation results demonstrated satisfactory characteristics in specificity, linearity, accuracy and precision.• This protocol avoids the need of laborious and costly customized monoclonal antibody as is typically essential for an ELISA or multistep enrichment process which are often indispensable when employing a liquid chromatography–mass spectrometry-based method.• The protocol is capable of quantifying up to 25 samples at the dynamic concentration range from 5 to 200 ng/ml with an LLOQ of the target protein at 0.4 nM (20 ng/ml).

方法学的优化，请阅读文章原文

领域：生物制药/仿制药

标签：PK，生物制药，Wes，活性成分定量，