血小板是参与止血的重要成分。止血过程中，血小板表面重要粘附受体（GPVI）通过免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM）、Src家族激酶（SFK）、第二信使信号系统，以磷酸化信号转导驱动的方式，触发瞬时血小板形态变化，介导血小板聚集与止血栓形成。因此，血小板GPVI信号系统在血管健康与疾病中发挥重要作用。然而，目前完整描绘血小板凝血调控机制的研究还未见报道。

 2020年7月，美国俄勒冈健康与科学大学的Joseph E. Aslan研究团队在《Blood》（IF=17.543）上发表了"Phosphoproteomic quantitation and causal analysis reveal pathways in GPVI/ITAM-mediated platelet activation programs“的研究文章，通过细胞生理学和磷酸化蛋白质组学，分析了ITAM血小板胶原受体GPVI下游信号传导机制。

实验设计

研究材料：

5名健康人的全血样本，流式细胞仪分选血小板样本

技术方法：

磷酸化蛋白质组学、蛋白质组学

技术路线：

研究结果

1、GPVI激活引起的血小板表型响应与蛋白激酶底物的磷酸化变化相关

血小板生理学研究发现，纯化的人血小板在GPVI特异性激动剂—交联胶原蛋白相关肽（CPR-XL）刺激后易于聚集，而抗血小板药物（腺苷三磷酸腺苷酶、吲哚美辛、整合素）的使用能消除CPR-XL（10ug/ml）对血小板聚集作用。进一步WB分析发现，在CRP-XL刺激的血小板裂解液中，抗血小板药物处理显著通过酪氨酸激酶、PKC、Akt和MAPK介导的磷酸化引起免疫活性增加。以上结果表明，GPVI激活能引起血小板表型响应，且与许多蛋白激酶底物的磷酸化变化相关。

GPVI介导血小板响应进展

2、磷酸化组学分析GPVI启动血小板激活的信号转导机制

为了分析仅由GPVI启动血小板激活引起的蛋白质磷酸化变化，使用CRP-XL刺激血小板的同时抑制ADP释放反馈、血栓素生成和整合素激活。从5名健康人中收集血液样本，并通过流式细胞仪分选血小板，将每个受试者的血小板样本分成对照组和CRP-XL（10ug/ml）刺激组，随后进行TMT磷酸化蛋白质组学分析。结果显示蛋白质磷酸化水平发生显著变化，而总蛋白质表达水平总体上无显著变化。

GPVI介导血小板激活的蛋白质磷酸化分析

3、血小板GPVI信号反馈机制研究

为确定ADP分泌和血栓素生成反馈是如何影响GPVI激活进而影响信号传导，作者开展了无三磷酸腺苷双磷酸化酶和吲哚美辛的定量蛋白质组学分析。在ADP分泌和血栓素反馈及CRP-XL刺激的处理下，发现磷酸化修饰层面发生显著变化，且显著变化的磷酸化蛋白主要参与囊泡介导的转运和细胞骨架重构生物学过程。差异磷酸化蛋白质还与血小板功能相关的几个Reactome途径显着相关，包括FcRγ和ITAM介导的Src家族激酶（SFK）下游的BCR和GPVI信号途径。

来自嘌呤和血栓素受体反馈的GPVI信号网络

4、血小板GPVI信号传导的因果关系分析

作者进一步通过CausalPath对上述鉴定到的血小板中差异表达修饰蛋白进行分析。CausalPath工具使用Pathway中积累的途径信息和其他数据库，基于可能的因果关系计算并确定成对的蛋白质磷酸变化。CausalPath分析推测，激活的p38磷酸化了STAT1 S727路径。此外，CausalPath识别了血小板GPVI（GP6）效应子上的许多具有因果相关性的磷酸化事件，包括SFK介导的FcRγ（FCER1G）磷酸化，以及后续的Syk，BTK，PLCγ2（PLCG2），PKCδ（PRKCD）和p38（MAPK14）。CausalPath还从底物磷酸化模式中推断出了PKCα（PRKCA）和PKA（PRKACA）的激活。

GPVI信号传导中差异磷酸化蛋白质的因果路径

5、验证GPVI信号传导关系

为验证由CausalPath推断的通路关系，在CRP-XL刺激之前将血小板与激酶抑制剂一起预孵育，然后对感兴趣的磷酸化位点进行WB分析。结果显示，与上述磷酸蛋白质组学数据一致，用CRP-XL刺激血小板上调了Syk Y525，DAPP1 Y139，PLCγ2 Y1217，PLCβ3 S1105，Hsp27 S82等位点磷酸化水平。

血小板GPVI信号关系和功能反应的验证

6、基于相互作用分析GPVI信号系统下游靶标

为深入分析磷酸化变化是如何参与GPVI介导的血小板功能，研究人员从STRING中生成了完整人血小板蛋白相互作用组。不符合上述因果模型差异磷酸化蛋白中，有1234个主要与血小板功能有关，在RhoGTPase信号传导和膜运输等途径中发挥作用。

RabGPTases是GPVI介导血小板功能的系统靶标

小编小结

本研究通过细胞生理学和TMT磷酸化蛋白质组学方法，对GPVI介导的血小板活化启动和进展两种条件进行分析，共鉴定到匹配1323个蛋白的3788个显著变化的磷酸化位点。通过文献指导的因果推导工具，从关键、新兴的GPVI效应子（包括FcRγ, Syk, PLCγ2, PKCδ,DAPP1）的磷酸化蛋白质组学数据中匹配到超过300个位点特异性的信号通路关系。通过信号验证研究和功能筛选，GPVI/ITAM途径范围内还考虑了其他特征较弱的靶标，包括Ras/MAPK轴蛋白（如KSR1,SOS1,STAT1,Hsp27）。此外，研究还阐明了GPVI/ITAM信号的调控网络，包括40多个Rab GTPase和相关调控蛋白系统，其中通过TAK1抑制作用阻断了GPVI介导的Rab7 S72 位磷酸化与内溶酶体成熟。本研究还提出了一种用于确定与血栓形成、血管炎症和其他血小板相关疾病状态有关的止血效应物、生物标志物和治疗靶标的方法。

值得一提的是，该文是首个利用高通量磷酸化组学，全面描绘血小板中GPVI受体下游的磷酸化信号网络的文章，表明磷酸化组学是完整解析信号转导机制的有效工具。中科新生命拥有多年的修饰蛋白质组分析服务经验，已协助客户在《Nature Genetics》《Cell Metabolism》《PNAS》等高水平杂志发表多篇论文，目前还推出了创新DIA磷酸化修饰蛋白质组服务，欢迎感兴趣的老师前来咨询！

领域：蛋白/抗体/蛋白质组,多组学/蛋白质组/代谢组/脂质组

标签：蛋白组 代谢组 多组学 中科新生命 磷酸化