脐静脉内皮细胞培养

一、试剂和缓冲液配制

1、胎牛血清（氯化十六烷基吡啶）

（1）解冻胎牛血清

（2）在56℃加热30分钟（脱补体作用，盖上瓶）

（3）取25ml上述液体放在无菌的50ml的falcon里分馏

（4）在-20℃冰冻馏份

2、磷酸盐缓冲液（PBS）

（1）无钙镁离子的100ML的PBS（10×）（生命技术）

（2）900ML蒸馏水

（3）2克葡萄糖

（4）在无菌的FALCON里过滤，分馏，在-20℃冰冻

3、胶原蛋白酶（0.2%在PBS溶液里）

（1）把0.2克的胶原蛋白酶溶解于100ML的PBS溶液里

（2）在暗箱（铝箔）里混合10分钟

（3）用氢氧化钠1N调整溶液PH值至7.40

（4）过滤（0.22U）

（5）分馏和冰冻在-20℃

4、保存和运输脐带的缓冲液

（1）PBS 50ML

（2）多粘菌素E，抗敌霉素[多肽类抗生素] 1ML

（3）青霉素G 1ML

5、培养基

（1）M199“stock”M199 Earle 10× 100ml，蒸馏水 900ml

（2）M199“完全”

谷氨酰胺 0.2M 1ML

羟乙基哌嗪乙磺酸 1M 1.5ML

37.5%碳酸氢钠（W/V） 1.8ML

青霉素 1ML

胎牛血清（加热至56℃，离心） 20ML

M199“stock” 加至100ML

在+4℃下保存1周

二、细胞培养

1 术前1天

（1）取一滴纤维结合蛋白覆盖有盖培养皿（35MM，7个/根脐带）

（2）准备3个装有50ML保存脐带缓冲液的容器

2 手术当天

（1）用一个容器装50ML生理纤溶酶，保存在37℃下（bain-marie）

（2）术前准备

取一根脐带（离体3个小时内，平均1小时，剪去夹伤部位）

2个50ML注射器，1个30ML注射器和1个10ML注射器

1个止血钳，2根插管，14号线2CM长，消毒巾，消毒手术刀和无菌手套

手术区域准备：一块床单和无菌手套封套