自1985年 Mullis 发明了体外多聚酶链反应(PCR)至今, PCR在遗传病、病原体、癌基因等分子诊断领域和法医鉴定等方面发挥了巨大作用.今天的第三代PCR技术, 即绝对定量的数字化 PCR也备受关注。来自西安交通大学生命科学与技术学院等处的研究人员近期发表综述，介绍了 PCR 技术的发展历程, 综述和讨论了绝对定量的数字化 PCR 的技术路线和应用进展, 总结提出了其进一步发展面临的问题, 并展望了数字 PCR 技术在生物医学方面的发展前景.
第一代 PCR(即终点法 PCR)在进行扩增后只能获得半定量的结果. 随着生物分子荧光技术的发展, 1992 年, 实时定量 PCR(RT-PCR)即基于荧光探针或染料的第二代 PCR 技术应运而生.该技术随后逐渐发展为检测目标片段的主流分子生物学技术. 在实时定量 PCR 过程中, 荧光信号随着扩增产物的积累而增强. 实时荧光定量 PCR 能够实时获得模板扩增的荧光值, 然后根据 DNA 模板在指数增长时期的 Ct 值与标准 DNA 的 Ct 值比较来计算初始模板的浓度. 但是这种方法由于是大体积反应系统, 非特异性的扩增增加了假阳性结果和背景信号, 因此, 最终无法获得绝对定量的结果(“绝对定量”指的是目标分子的数量).
如今, PCR 技术为了达到绝对定量化已经发展到了第三代, 即数字 PCR(digital PCR), 相比较于第一代和第二代 PCR技术, 微量的样品就足以获得可靠的检测结果. 其中的“数字”被解释为单一实体中信号的开关(如开或关,凝固的或非凝固的, 激活的或非激活的, 荧光的或非荧光的, 有差别的和无差别的).
数字 PCR 是在有限稀释条件下将单个待检测的 DNA 模板分散于单个重复的反应体系中, 每个反应体系中有一个 DNA 模板没有 DNA 模板(统计上), 这样极大减少了扩增后DNA 模板检测的背景荧光[10]. 数字 PCR 具有显著提升检测通量, 极大提高检测精确性, 提升检测浓度下限的优势.
在数字 PCR 中, DNA 模板扩增前被稀释到一定的浓度, 在此浓度下, 包含单个 DNA 模板的微体系通过扩增被荧光探针检测到并产生某种颜色荧光的特定信号, 而不包含单个 DNA 模板的微反应体系则不能产生荧光信号. 因此, 通过计算产生阳性信号的微反应体系数量就能提供一个准确的数字化结果.通过此方法, 样品中的初始目标 DNA 模板就能够被绝对定量, 这样极大降低了 PCR 产生的扩增偏倚(即非特异性的扩增). 随着 PCR 相关技术的飞速发展,现在可以利用微纳技术实现数字 PCR 实验的特殊需求. 然而由于该技术尚处于发展阶段, 存在技术缺陷导致的假阳性、昂贵的实验成本、复杂的实验过程、临床研究缺乏等丞待解决的挑战. 所以对这一新兴领域做一个全面的概述是非常必要的.
近期, 越来越多的人开始关注数字 PCR, 科学引文索引收录的相关文章的数量也在飞速增长. 该领域综述性文章主要涉及数字 PCR 发展史以及相关应用, 极少涉及该领域技术路线的分类和对比, 以及不同技术路线催生的产品和应用范围. 毋庸置疑, 作为一种绝对定量的分子生物学研究工具, 数字 PCR将在 DNA的定量检测中承担越来越重要的角色.
这篇文章首先按照不同样品分散方法对数字 PCR 的技术路线做了清晰的划分, 同时介绍了不同技术路线中的新兴技术, 最后展示了目前数字 PCR 的相关应用. 其中, 尤其对数字 PCR 的关键技术路线及其发展水平进行了介绍, 包括样品的分散, 信号放大(即多聚酶链式反应), 荧光图像的获取和处理, 并进一步概述了新兴的可与数字 PCR 整合的微纳技术.
作者指出，因为其独一无二的检测精确性, 数字PCR 在生物医学领域中具有广泛的应用. 然而, 具有高通量、微体系、高灵敏度的数字 PCR 技术在进一步发展中仍受制于一些因素. 尚需解决以下问题:
(ⅰ) 如何不借助仪器, 在微孔板或者微流控芯片上进行简单、稳定且高效的液体(液滴)操纵, 以产生单分子的 PCR体系；
(ⅱ) PCR热循环和液体操纵过程中微体系之间的良好独立性如何实现；
(ⅲ) 如何能在不影响数据质量和检测速度的同时做到检测系统小型化；
(ⅳ) 借助微体系分割, 数字 PCR检测到的样品浓度极限能够达到什么数量级.
随着微纳加工、荧光成像、微流控等领域的快速发展, 在高精度、短时间核酸检测需求的推动下, 数字 PCR 领域面临的问题将会被一一解决, 从而实现分子诊断领域的跨越式发展. 数字 PCR 是一项非常有前景的 DNA 定量检测技术, 然而目前依然处于实验研究阶段. 虽然市场上已经存在商品化的数字PCR 平台, 但这些产品大多价格昂贵且功能集成化程度较低, 同时对于多目标物的检测能力较弱. 这些方面也限制着数字 PCR 技术的应用与普及, 同时也正是该领域的研究者应该去解决的问题. 期待在不久的未来, 整个数字 PCR 检测系统在交叉领域发展的推动下, 可以实现结构的极大简化, 功能的高度集成以及成本的最大削减, 并被应用于生物医学检测的最前沿领域, 最终走进人们的日常生活.
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