基因编辑工具的快速发展令整个生物学研究领域疯狂，目前第三代DNA剪刀的主角是CRISPR，这是一种比其前身更快更便宜的工具。近期来自中科院神经科学研究所的杨辉研究组与多个研究组合作，在Cell Research杂志上发表了多篇文章，获得了CRISPR-Cas9技术的重要突破。
研究组成员通过与施霖宇团队与苏州非人灵长类研究平台孙强团队合作，设计了一种以同源臂介导的末端接合（Homology-Mediated End Joining, HMEJ）为基础的基因敲入策略，它在很多种系统（体外培养的细胞、动物胚胎和体内组织）中比现有的基因敲入策略的效率都要高。基于更高效的编辑效率和更好的精确度，HMEJ介导的基因敲入方法为一系列应用，包括基因编辑动物模型的建立、疾病的靶向基因治疗等提供了非常大的应用前景。
常用的同源重组（HR）策略介导的基因靶向整合在动物胚胎和组织中效率低下。而且NHEJ介导的修复系统会导致随机方向的整合，以及在接合处引入各种形式的插入、删除或突变，使得这种方法难以通过同框整合的方式形成内外源融合基因以形成嵌合蛋白。即使是之前报道的MMEJ策略，也只能在某些系统内提高效率。因此，研究者们试图探究是否存在一种在多个系统内都可以有更高效的编辑效率和更好的精确度的基因靶向整合策略。
在这项研究中，研究人员基于CRISPR/Cas9系统，设计了一种新的以HMEJ为基础的靶向精确整合策略，即利用带有单个向导RNA（sgRNA）靶向位点和长同源臂（约800bp）的供体载体来实现高效的精确整合。
为了验证这一想法，研究人员构建了四种类型的供体载体来比较敲入效率： HMEJ供体（sgRNA靶向位置序列加在800bp长度的同源臂两端）、HR供体（只有800bp长度的同源臂）、NHEJ供体（只有sgRNA靶向位置序列）以及MMEJ供体（sgRNA靶向位置序列加在20bp的微同源臂两端）。然后将这四种系统分别在体外培养的细胞系，小鼠和猴胚胎以及成体组织上进行效率比较。
他们发现在体外培养的小鼠ES细胞和N2a细胞中，HMEJ为基础的定向整合效率与HR方法相比较并无显著提高。然而，在原代星形胶质细胞和神经元细胞中，HMEJ方法具有很高的DNA敲入效率。更重要的是，在小鼠和猴子胚胎中展现了非常强大的基因敲入能力。此外，通过尾静脉水动力注射法感染成体小鼠的肝细胞，发现HMEJ介导的基因敲入效率远高于以HR、NHEJ和MMEJ为基础的策略。采用AAV定点注射感染小鼠的视皮层区（V1），结果显示HMEJ介导的在成体非分裂的成熟神经元中靶向整合效率可以达到50%左右。最后，研究者对HMEJ介导的基因靶向整合的机制进行了探讨。
这一工作建立了一种新的基于HMEJ的靶向精确整合策略，即利用带有单个向导RNA（sgRNA）靶向位点和长同源臂（约800bp）的供体载体来实现高效的精确整合。HMEJ介导的基因敲入方法拥有更高效的编辑效率和更好的精确度，为包括基因编辑动物模型的建立和疾病的靶向基因治疗等应用提供了非常大的前景。
此外，杨辉研究组还与熊志奇研究组，神经所苏州非人灵长类研究平台孙强团队合作，通过将多个针对基因外显子的连续指导RNA（sgRNA）注射到受精卵中，可以高通量制作各种基因完全敲除小鼠并用于表型分析，并快速制作基因敲除猴模型。
CRISPR/Cas9系统是一种非常高效的基因编辑方法，但是大部分被基因编辑过的动物都有嵌合性，也就是说它们只有一部分细胞的基因发生了编辑。对于涉及表型的研究而言，嵌合的基因编辑动物需要进一步地杂交育种，才能得到完全的基因敲除动物。当涉及大型动物，比方说非人灵长类时，嵌合体的问题就会显得尤为严重，因为猕猴的繁殖周期长达5-6年而且每胎只生一个幼崽。之前有许多研究者都试图一步法来产生没有嵌合的基因修饰动物，尤其是大型动物。包括将Cas9 mRNA和sgRNA注射到卵母细胞中而非受精卵中，或注射Cas9蛋白，或注射双sgRNA。但是DNA测序分析了这些方法的动物个体组织后，发现这些方法完全做到双等位基因敲除的效率相当低。
这项研究中，研究人员发现向受精卵当中注射Cas9 mRNA和多个sgRNA的鸡尾酒式混合物，单个或多个基因在小鼠胚胎能做到100%的完全删除，以及猴子胚胎中91%-100%的删除。这种方法能同时产生插入缺失和外显子删除，从而实现高效的基因完全敲除。研究者还应用C-CRISPR法建立基因功能完全敲除的F0代小鼠，用于基因功能的快速表型分析，以及获得基因功能完全敲除的F0代猴。最后，通过高通量测序分析显示，C-CRISPR在基因编辑过的小鼠和猴子中不会引入明显的脱靶改变。
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