基材
色谱柱的基质分为硅胶基质填料，聚合物基质填料，其他无机填料。
硅胶基材填料：
1、正相色谱
正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica），以及其他具有较强极性的官能团，如氨基基团和氰基基团的键合相填料。
由于硅胶表面的硅羟基（Si-OH）或其他基团的极性较强，因此，分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小，即极性弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正乙烷、氯仿、二氯甲烷等。
2、反相色谱
反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，乙腈等混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。
常用的反相填料有C18、C8、C4、Phenyl等。
聚合物基材填料
聚合物基材多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要优点是在pH值为1-14均可使用。
相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。
聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效教低。
其他无机填料
其它无机填料的色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如石墨化碳也正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性，该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强，石墨化碳可用于分离某些几何异构体；又由于在HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何pH与温度下使用。
氧化铝也可用于HPLC，氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在pH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用。
新型氧化锆填料也可用于 HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用pH范围1~14，温度可达到1000℃。由于氧化锆填料几年前才开始研究，加之前的实验难度，其重要用途与优势尚在研究中。
柱子的pH使用范围
反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的pH范围。一般的C18柱pH值范围都在2~8，流动相的pH值小于2时，会导致键合相的水解；当pH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况，色谱柱入口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相pH较高或经常使用缓冲液时，建议选择pH范围大的柱子。比如Waters的XBridge系列色谱柱，pH使用范围在1-12，对碱性化合物具有很好的分离能力。
填料的端基封尾
把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品是酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。
怎样选择填料粒度
目前，商品化的色谱料粒度从1μm到超过30μm均有，而目前分析分离主要用3、5、10μm填料，填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，填充柱的柱效越高；小于3μm的填料应用，在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是唯一的因素。如果固定相选择正确，但是分离度不够，那么选择更小粒度的填料是很用有的，3μm填料填充柱的柱数比相同条件下的5μm填料的柱效提高近30%；然而，3μm的色相谱的背压却是5μm的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选择更短的色谱柱，以缩短分析时间。另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力。
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