2、溶剂的处理和更换
液相色谱溶剂应尽量使用HPLC级溶剂。HPLC级试剂是用特殊方法生产的含有最少的微粒和最低的紫外吸收物质。水也应达到HPLC级。液相色谱实验室应配有纯水发生器。非色谱纯溶剂可通过蒸馏方法进行提纯，除掉大部分有紫外吸收的杂质。另外，用氧化铝或硅胶柱可除去极性强的化合物。
理论上，完全由HPLC级溶剂组成的流动相不必过滤（但因操作过程中，因溶剂本身，容器、环境等原因，建议在进入系统使用前使用相应的滤膜进行过滤操作），其他溶剂由于含有不溶性微小颗粒，会逐渐堆积在色谱柱中堵塞流动相的通道，使柱压力升高，柱效率下降，因此使用前一定要用0.2～0.5um 的过滤器过滤。当使用固体化学试剂(如缓冲盐)配制流动相时过滤特别重要，不能让固体微粒污染泵的单向阀、阻塞、损坏进样器和柱头过滤片。现有过滤器有水溶性和脂溶性两种过滤膜供选择。过滤水溶性流动相时(如甲醇／水)，先用1～2 mL甲醇润湿过滤膜，有助于快速抽滤。
流动相在使用前必须进行脱气处理(连同贮液器一起脱气效果更好)，以除去其中溶解的气体，防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。若在死体积检测池中，存在气泡会增加基线噪声，严重时会造成分析灵敏度下降。流动相中的氧气对光电检测器影响最大，使紫外检测器基线增高，低波长检测时信号被抵消掉。在荧光检测中O2会使样品的荧光淬灭，降低灵敏度，还会导致某些组分被氧化或使柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。常用的脱气方法有① 氦脱气；② 加热回流；③ 真空脱气；④ 超声波脱气。从脱气速度和效果看，加热回流法最好，但操作不方便，存在着火的危险。对于混合流动相不提倡用此法，因为挥发性组分会损失掉，改变流动相的组成。超声脱气法只能除去3O 的溶解气体效果最差。近年来新出现的在线真空脱气法(on—line degasser)，把真空脱气装置串接到贮液系统中，并结合膜过滤器，实现了流动相在进人输液泵前的连续脱气。其脱气效果明显优于上述4种方法，并适用于多元溶剂体系。
在HPLC中需要经常更换新溶剂。更换溶剂时，必须将原有的溶剂冲洗干净。如果新旧溶剂是互溶的，则必须保证新溶剂使色谱柱重新达到平衡。否则将产生基线漂移。若新旧溶剂不互溶，则要选择与原溶剂和新溶剂(正相和反相)都相溶的过渡溶剂冲洗，然后再用新溶剂冲洗。如异丙醇是1种很理想的过渡溶剂。特别要注意防止新旧溶剂发生反应或生成沉淀物，否则将给管路、泵及检测器带来污染和堵塞，给清洗工作带来麻烦。
如果缓冲液反相流动相被正相流动相所污染，产生缓冲盐沉淀，可用5倍柱体积的非缓冲液反相流动相冲洗系统，再用10倍柱体积的强溶剂(如乙腈)通过系统，最后用50倍柱体积的异丙醇冲洗系统，以除去所有滞留的流动相和溶剂残留，换上反相流动相冲洗，使系统重新平衡。如果正相流动相被水溶性溶剂所污染，先用50倍柱体积的异丙醇冲洗，而后用正相流动相冲洗。在分析样品前，最少需用10倍体积的最终流动相冲洗系统。
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