摘 要：酶联免疫法（ELISA）是以酶标记抗体或抗原为主要试剂的一种标记免疫分析技术，其结合了抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用，具有灵敏度高、特异性强、准确性好、检测成本低、迅速等优点，该方法近年来被广泛应用于食品安全中农药残留的检测。
古语有云：“民以食为天”，随着人们生活水平的提高和经济的发展，人们不只是关注食品的口味和营养，而对食品的品质与安全更加重视。如何快速、有效检测食品中的污染物残留，确保食品的安全性成为食品行业面临的重要课题。酶联免疫吸附技术（ELISA）是在免疫荧光和放射免疫分析技术基础上形成的一种免疫分析方法。目前用于食品安全检测的方法有很多，如气相色谱、高效液相色谱、薄层色谱和质谱等。这些方法准确，但速度慢，且设备昂贵，检测费用高，难以推广使用。而酶联免疫分析法不仅特异性高、灵敏度高、干扰小、简单迅速、安全性高、不需要昂贵仪器设备，特别适合于对大量样本的筛检工作，能广泛用于多个领域[1]。
1 酶联免疫法概述
ELISA是1971年Engvell[2]等人建立在免疫酶基础上的一种新型免疫测定技术，该技术的建立被认为是血清学实验的一场革命，是令人瞩目的有发展前途的一种新技术。20世纪90年代末期，ELISA技术不断发展以及全自动酶标分析仪的应用，使其特异性与灵敏度有很大提高，在食品检测领域中的应用大大扩展。
ELISA的基本原理将抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。抗原或抗体再与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，酶作用于底物使其所含的供氢体由无色变成有色，发生颜色反应。因此，可通过底物的颜色变化来判定是否有相应的免疫反应，且颜色反应的深浅程度与样本中相应抗体或抗原的量呈正比，因此可借助吸光度值计算抗原（抗体）的量，ELISA法可进行定性和定量测定[3]。在上述反应中，酶促反应只进行一次，而抗原一抗体的免疫反应可进行一次或多次。由于酶的催化频率很高，因此反应效果可被极大地放大，从而使测定方法达到很高的敏感度。这就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性相结合，使ELISA方法成为既特异又敏感的检测方法[4]。
2 食品中农药残留的检测
农药残留是指农药使用后残存于食品原料与半成品食品及成品中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物以及杂质的总称。农药残留在人体内积蓄后容易引起慢性中毒，出现神经功能紊乱、精神错乱、皮肤刺激等症状，不容小视[5]。20世纪80年代开始，农药的免疫检测技术作为快速筛选检测方法得到了快速发展。目前几乎所有农药类别都建立了ELISA法，检测样本以农产品、食品、饲料和环境样本为主 [6]。
2.1 ELISA抗原与抗体的制备
2.1.1 半抗原的设计和人工抗原的合成
抗原是指能够引起机体特异性免疫应答，并能与相应抗体发生特异性反应的物质，即同时具有抗原性和免疫原性。具有免疫原性的物质必然具有抗原性，半抗原则是指不具有免疫原性而只有抗原性的物质。半抗原相当于一个抗原决定簇，即只具有抗原性，不具有免疫原性；能与抗体结合，不能诱导机体产生免疫应答。抗原的纯净度会影响到抗体制备的质量，也会间接影响ELISA的效果。因此，制备有良好免疫原性且稳定的人工抗原是ELISA的关键环节。农药分子一般为不含蛋白质的小分子物质，是只具有抗原性的半抗原，不能刺激机体产生免疫反应，只有偶联到大分子载体（一般为蛋白质）上，才能诱导机体产生抗体。因此首先需要对其进行结构修饰，使之成为可用的半抗原。典型的半抗原结构中应具备适当末端活性基团，如-NH2、-COOH、-OH、-SH等，可直接与载体偶联；同时活性基团与载体之间应具备一定长度的间隔臂，一般为4～6个碳链长度（0.5～0.8nm）；为使形成的抗原具有较强免疫原性，半抗原主体结构中尽可能含有芳香环。另外，半抗原的设计应考虑到农药样本和具有毒理学意义的代谢物，针对被测定对象是单一的农药或某一类农药，设计中应相应地突出农药分子的结构或一类农药分子中共有的结构部分，制成单一的特异性抗体和簇特异性抗体[7]。半抗原修饰好后，在水介质及温和条件下，与合适的载体蛋白以共价键偶联，使之具有免疫原性，称之为人工抗原。如果农药分子上具有反应功能团，那么可根据具体情况用适当的交联方法与双功能交联试剂使半抗原与载体结合。如果是羧基半抗原，可利用羧基通过混合酸酐法或碳二亚胺法等方法；如果是氨基半抗原，则多采用重氮化法或戊二醛法；如果是羟基半抗原，则可直接与丁二酸酐衍生后再与蛋白质交联；如果是巯基半抗原，则可通过同源或异源双功能试剂与蛋白质交联；而酮基半抗原则常用氨基氧乙酸化[8]。如果农药分子上不具有反应功能团，则需利用化学衍生方法引入制成半抗原，再与载体结合。
不同的农药应选择与其相适应的衍生方法，目前常见的是以下方法：用与半抗原结构相似的但具有反应活性基团的化学试剂；对其分子进行改造后使分子内产生羧基基团；在分子内引入元素氯，利用氯原子的活泼性达到所需反应的目的；重新合成半抗原，并在合成过程中选择适当步骤用一个有反应功能团的分子参与反应，从而合成出有反应功能团的半抗原分子；选择半抗原的代谢产物来合成人工抗原[9]。
2.1.2 抗体的制备
抗体的制备包括佐剂的选择、免疫动物的选择、免疫途径和抗体特性。一般可采用两种途径产生抗体：一是多克隆抗体技术，二是杂交瘤技术生产单克隆抗体。多克隆抗体可用农药―载体蛋白结合物直接免疫兔子等动物，并从被免疫的动物血清中来获得。在免疫动物每公斤体重几十mg到十几mg范围内，设定2～3个免疫剂量进行动物免疫。初次免疫时，需加入等量福氏完全佐剂，以提高抗原的免疫原性。一般每隔1周、2周、1个月或2个月在白兔背部皮内或大腿肌肉注射，共计注射8～9次。在最后一次免疫后7天采血测试。当血清抗体达到一定滴度后灭菌采血，离心取血清，在-20℃保存。采用多克隆抗体方法具有生产成本低、方法简便等优点，但是其抗体的特异性不够强，会随着动物种类及个体差异而有变化，易发生交叉反应，生产数量上也会受到一定的限制，不利于批量生产。20世纪70年代发展起来的单克隆抗体技术，发展至今已逐渐成熟。单克隆抗体是指在1株B淋巴细胞系中的每个细胞只能产生1种专有的、针对1种能识别抗原决定簇的抗体。由这样1株B细胞系产生的抗体即为单克隆抗体。由于该抗体是针对抗原某一决定簇的，因而是一种高特异性抗体。虽然单克隆抗体对设备要求相对较高，技术相对复杂，且成本较高，但是其交叉反应少，特异性强，并且便于批量生产，为生产商品检测盒提供了极为有利的条件，因此已有学者逐渐转入研究农药单克隆抗体的ELISA技术 [10]。国内外对于农药小分子的免疫分析研究大多集中在针对单个农药小分子进行的半抗原设计和合成及抗体的制备，即一种抗体只对单一目标化合物有特异性识别和检测能力，对于多种农药残留的研究还很少。 2.2 ELISA在农药残留检测中的应用
自20世纪80年代开始把ELISA应用于食品农药残留检测以来，国内外已有大量文献报道。检测的食品范围包括水果、蔬菜、饮料、酒类、鱼、肉、猪油、奶、植物油、豆类、谷物及谷物加工产品等。表1列出了国内外有关食品中杀菌剂、除草剂、杀虫剂等农药残留ELISA检测的一些文献报道。
3 结论与前景
食品安全检测的发展方向是快速、灵敏、简便。ELISA作为固相免疫分析中应用最广的一种，由于其独特的优越性已经被广泛应用于其中。与其他检测方法相比，ELISA具有高度的特异性和灵敏性，结果准确，重现性好，样品处理量大，但依然存在着诸多不足。比如，对试剂的选择性高，对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应，结果易出现假阳性等。不过随着新的功能材料、新标记技术的发展、界面化学的进步以及新的固相处理技术的应用，相信ELISA会朝着智能化、自动化、微型化方向发展，在未来食品安全的快速检测中将发挥越来越重要的作用。
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