细胞计数及活力测定

一、原理

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

计算细胞数目可用血球计数盘或是 Coulter counter 粒子计数器自动计数。 血球计数盘一般有二个 chambers，每个 chamber 中细刻 9 个 1 mm正方形再细刻 16 个小格，深度均为 0.1 mm。当 chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为 1 mm² x 0.1 mm=1.0 x 10^-4 ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以 10^4，即为每 ml 中之细胞数目。

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。

存活测试之步骤为 dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之 trypan blue 染料，如果细胞不易吸收 trypan blue，则用红色之 Erythrosin bluish。

利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。

二、仪器、用品与试剂

0.4 % w/v 台盼兰 trypan blue （GibcoBRL 15250-061）Erythosin bluish stain

取 0.1 gram Erythrosin bluish （Sigma E-9259） 及 0.05 gram preservative methylparaben （Sigma H-3647） 溶于 100 ml Ca++/Mg++ free saline血球计数盘及盖玻片 （Hem℃ytometer and coverslip）

计数器 （counter）

低倍倒立显微镜

粒子计数器 （Coulter counter, Coulter Electronics）

三、操作步骤

（一）细胞计数

3.1. 取 50 ml 细胞悬浮液与 50 ml trypan blue （or Erythrosin bluish） 等体积混合均匀于 1.5 ml 小离心管中。

3.2. 取少许混合液 （约 15 ml） 自血球计数盘 chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于 100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色 （ 或红色- Erythrosin bluish） .

3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除 4，乘以稀释倍数 （至少乘以 2，因与 trypan blue 等体积混合），zui后乘以 10⁴，即为每 ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线 上，只计上线与右线之细胞 （或计下线与左线之细胞）。

3.4. 若不用血球计数盘，可用 Coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细 胞。

然后按下式计算：

细胞数/ml=4 大格细胞总数 x 2/ 4×10000

注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占 10% 以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

（二）细胞活力

1、将细胞悬液以 0.5 ml 加入试管中。

2、加入 0.5 ml 0.4% 台盼兰染液，染色 2一3 分钟。

3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。

4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。

死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用 .

范例：

T75 monolayer culture 制成 10 ml 细胞悬浮液，取 0.1 ml 溶液与 0.1 ml trypan blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。

活细胞数/方格：55 ,62, 49, 59

死细胞数/方格：5, 3, 4, 6

细胞总数= 243

平均细胞数/方格= 60.75

稀释倍数= 2

细胞数/ml:60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106

细胞数 /flask: 1.22 x 106 x 10 ml = 12.2 x 106存活率：225/243﹦92.6 %

（三）MTT 法测细胞相对数和相对活力

活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使 MTT 分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。

l、细胞悬液以 1000rpm 离心 10 分钟，弃上清液。

2、沉淀加入 0.5-1 ml MTT,吹打成悬液。

3、37℃ 下保温 2 小时。

4、加入 4—5 ml 酸化异丙醇（定容）。打匀。

5、1000 rpm 离心，取上清液酶标仪或分光光度计 570 nm 比色，酸化异丙醇调零点。

注意：MTT 法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。

附：

1、0.4% 台盼兰染液配制：

台盼兰 0.4 克 加双蒸水至 100 ml.Cbeqe

2、MTT 配制：

MTT 0.5 克，溶于 100 ml 的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4℃ 下保存。

3、酸化异丙醇配制：

异丙醇中加入 HCl 使zui终达 0.04mol/L.