电子显微镜虽然神通广大，却也有许多难以克服的缺点。一个大的问题是，空气中的分子会和电子作用，使得它们不能到达我们需要观察的样品。正因为如此，使用电子显微镜观察样品时，样品必须放置于高真空环境。这大大提高了仪器的成本，因为一个好的真空系统往往造价不菲。同时，真空环境也使得我们无法准确观察某些样品。例如用电子显微镜观察某个物体表面的水滴显然是不可能的—真空环境下水早变成蒸汽跑掉了。
另一个大的问题是，使用电子显微镜观察样品时往往需要对样品进行一些特殊的处理。例如用于观察表面结构的扫描电子显微镜要求样品表面必须导电，对于不导电的样品如塑料、陶瓷或者生物样品，表面必须事先覆盖上一层金属。这样的处理不仅费时费力，而且有可能遮掩住样品的一些结构甚至破坏样品，使得我们观察到的结果偏离了真实的情况。为了克服这些问题，在上个世纪80年代，人们又开发了一种更简便快捷地观察微观世界的工具——原子力显微镜。
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