对于厚度小于 5μm 的样品，比如贴壁细胞或很薄的组织切片，在常规的宽场荧光显微镜下，定量的共定位分析一般是可以的。然而，对于厚样品，图像应以具有一定轴向尺寸的光学切片来记录，来分析看起来共定位的荧光团是否真正位于同一个侧向焦平面上，或在 Z 轴上他们是否彼此叠加。厚样品的荧光团共定位分析应通过获得薄的光学切片来进行，可用激光扫描共聚焦显微镜、或转盘共聚焦显微镜或多光子显微镜。多光子显微镜经常用单个近红外激光，在物镜焦点处的特定区域激发双标样品的两个荧光团。这些技术将荧光发射局限在仅位于焦平面上的荧光团，这样大大降低了光漂白和背景噪音。
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