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自发荧光（对甲醛固定的组织样品尤为显著）产生的问题在表现上与串色类似。有自发荧光的样品激发后经常会在其他通道检测出荧光发射，使得到的照片看起来有共定位荧光团。如用抗体和合成荧光团对背景过度染色，也会在两个荧光团非特异性标记明显的地方产生看起来像共定位的图像。这个假象可以通过认真地制备样品、用合适的 control 监测实验方案来避免或明显降低。
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