紫外分光光度法
测定灵芝孢子粉多糖含量的方案
实验参与人员：
实验进行的时间：
一、实验目的
建立灵芝孢子粉多糖的含量测定的方法。
二、 操作步骤
1. 对照品溶液的配制：
取无水葡萄糖约10mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀，加甲醇定容，制得对照品贮备溶液。
2.测定波长的选择：
加显色剂的空白溶液：精密称取苯酚约0.5g，用100ml蒸馏水定容。
对照品溶液：密量取对照品溶液0.5ml于10ml刻度试管中，加入1.0ml的5%苯酚溶液，迅速加入7.0ml浓硫酸，加蒸馏水至刻度，振摇5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min即的。
测定：在可见光区200-700nm内对三份溶液进行扫描，确定显色剂是否影响吸光度，确定对照品溶液的最大吸收波长。
照紫外-可见分光光度法（2010版药典附录V A ）测定,待测定对照品溶液的吸收光谱中显示，无水葡萄糖在与苯酚、浓硫酸显色后，在480-510nm处有明显紫外吸收，λmax=492nm，故确定测定紫外吸收的测定波长为492nm。
3. 供试品溶液的制备方法考察
取灵芝孢子粉粉末（过四号筛）0.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加水90ml，加入回流3h，放冷，摇匀，精密量取50ml，加入乙醇150ml，摇匀，4℃放置12h，取出，离心，倾去上清液，沉淀加水溶解并转移至150ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，为供试品溶液。
4. 标准曲线的绘制
精密吸取对照品溶液0.10ml，0.15ml，0.20ml，0.25ml，0.3ml分别置于试管中，加入1.0ml的5%苯酚溶液，迅速加入7.0ml浓硫酸，加蒸馏水至刻度，振摇5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min，以蒸馏水为空白对照，在最大吸收波长处测定各溶液吸光度。以对照品质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
5. 方法学考察
5.1精密度试验
取标准曲线项下1.5mL无水葡萄糖对照品溶液制备的样品，在最大吸收波长处连续测定吸光度6次，求出RSD。
5.2稳定性试验
取药材0.5g，精密称定，按供试品制备方法制备溶液，精密量取该供试品溶液0.5ml，加入1.0ml的5%苯酚溶液，迅速加入7.0ml浓硫酸，加蒸馏水至刻度，振摇5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min，在反应后10min，15min，25min，35min，45min，60min，在最大吸收波长下测定吸光度,求RSD值。
5.3重复性试验
取一份药材约0.5g，精密称定，分别精密量取6份供试品溶液0.5ml，供试品制备方法制备溶液，在最大吸收波长下测定吸光度，按测定数据求出多糖含量，并求算平均含量和RSD。
5.4加样回收率试验
精密称取同一批号的样品约0.25g，共6份，分别精密加入对照品储备液2.5ml，按照供试品制备方法制备溶液，照标准曲线制备项下的方法，依法显色，测定吸光度，按测定数据求出各自的多糖含量，并得到回收率及RSD。
样品溶液的制备 取灵芝孢子粉粉末（过四号筛）0.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加水90ml，加入回流3h，放冷，摇匀，精密量取50ml，加入乙醇150ml，摇匀，4℃放置12h，取出，离心，倾去上清液，沉淀加水溶解并转移至150ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，为供试品溶液。
测定 分别精密吸取0.5ml样品溶液至试管中，加入1.0ml的5%苯酚溶液，迅速加入7.0ml浓硫酸，加蒸馏水至刻度，振摇5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min，以蒸馏水为空白对照，在最大吸收波长处测定吸光度，从标准曲线上读出样品溶液中含多糖的含量，计算其含量，即得。
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