近日，制备纯化实验室的纯化工程师接到某制药公司委托的样品制备纯化任务，需要对某极性很大且难溶于水的样品进行制备纯化。基于样品的性质，小钱首先想到了正相分离模式，但是经过小量样品的纯化预实验后，小钱发现样品在正相分离柱上保留太强以至于很难洗脱下来，看来正相模式是行不通了。
没关系，还可以尝试反相分离模式，于是小钱称取了50 mg样品，溶于5 mL乙腈/甲醇/水/DMF（V:V:V:V=23:23:2:2）中，超声加热使样品完全溶解，然后根据样品的HPLC分析条件设置好洗脱梯度，并根据实际制备分离过程中的出峰情况实时调整梯度设置，制备纯化的实验条件如表1所示。
表1. 小量样品制备纯化实验参数设置
图1. 小量样品的制备分离图谱
制备分离图谱如图1所示，从预实验的分离结果来看，目标产物可以与杂质有效的分离，且分离度较高，可以满足目标物和杂质分别收集的需求。于是，小钱接下来进行了放大实验，她将1 g样品溶于50 mL甲醇/乙腈/水/DMF（V:V:V:V=23:23:2:2）中，超声加热使样品完全溶解，然后设置好制备纯化实验的参数，如表2所示。
表2. 样品量放大后的制备纯化实验参数设置
图2. 样品量放大后的制备分离图谱
制备分离图谱如图2所示，分析图谱可知，在上样量放大20倍后，所用分离柱放大了相应的比例，但由于样品的溶剂问题使分离结果与预期不符。因DMF在紫外检测波段有强吸收，会干扰样品的检测，因此在配置样品溶液时使用了高比例的甲醇和乙腈。在此条件下大体积上样时形成了体积过载，因此大量样品随着洗脱溶剂很快就被洗脱出来，未能获得有效的保留和分离。此外，由于330 g纯化柱有效柱床高度相比25 g纯化柱没有成比例的增加，因此前者的柱效相比后者下降较多，这也导致了分离图谱中目标产物与杂质未能有效分离。小钱在与同事们讨论后，决定只好放弃一步到位的想法，利用DMF溶剂溶解少量样品后，分多次对样品进行制备纯化。
小钱称取了600 mg样品，溶于6 mL DMF中，超声加热使样品完全溶解后，开始进行样品分离纯化实验，实验参数设置如表3所示。
表3. 改进后的放大制备纯化实验参数设置
图3. 改进后的样品制备分离图谱
小钱利用相同的实验参数设置，对总计6.5 g样品进行了多次进样，图3所示为其中两次的样品制备分离图谱。分析图谱可知，在减小样品进样体积后，样品得到了有效的分离纯化，目标产物和杂质分离度良好，且分离重现性不错。经HPLC分析，纯化后收集的目标产物纯度为98.4%，回收率89.4%，杂质纯度为88.1%，回收率74.8%，样品分离前后的HPLC分析图谱如图4所示。
图4. 分离前样品、分离纯化后得到的目标产物及杂质的HPLC分析图谱
总结这个样品制备纯化案例，在对此类具有很大极性同时又难溶于水的样品进行分离纯化时，可以参考本案例中的思路，即采用少量有机相溶剂对样品进行溶剂后，分多次进样，进而完成全部样品的制备纯化。
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