尽管在20世纪60年代后期首次描述了在哺乳动物组织或液体中，有囊泡在细胞周围存在，但是直到2011年才提出通用术语“胞外囊泡（extracellular vesicle, EV）”来定义所有的由脂质双层包围的胞外结构，如图1所示。在1980年代，人们描述了EV可以通过质膜向外出芽或通过细胞内内吞运输途径形成，其中这种细胞内内吞运输途径涉及多泡晚期内吞区室---也称为多泡体（multivesicular body, MVB）---与质膜的融合，如图2所述。这种融合事件导致这些区室中的管腔内囊泡（intraluminal vesicle, ILV）释放到细胞外，从而产生一种称为外泌体（exosome）的EV亚型，而且所产生的外泌体具有与ILV相同的大小（直径<200nm）。
图1.不同胞外囊泡（EV）亚型的物理特征。
人们最初认为外泌体分泌是细胞清除不想要的蛋白的一种机制。然而，20世纪90年代后期的研究表明，它可以起到细胞间通讯的作用，特别是在免疫反应和癌症中。对这一概念的强烈支持出现在2007年，在那年科学家们已证实外泌体含有mRNA和microRNA，而且当被转移到受者细胞时，所含有的mRNA和microRNA仍然保持功能并改变细胞行为。与此同时，EV被称为微泡（microvesicle），微粒（microparticle）或核外粒体（ectosome），很可能是从质膜释放出来的，而且也已经证实能够在细胞之间转移功能性的蛋白和RNA。
图2.胞外囊泡（EV）分泌机制。
人们已观察到在各种细胞类型中，大小与外泌体一样或更大的EV是从细胞主体的质膜或膜延伸物（比如微绒毛、丝状伪足，纤毛和鞭毛）出芽而形成的。大小与外泌体相当的EV在大小、密度和膜定位方面具有与外泌体相同的生物物理特征，因此，目前的方法无法有效地将它们区分开来。
细胞释放出的源自MVB的外泌体与其他小型EV的相对比例是高度可变的，取决于细胞类型、环境条件和其他因素（比如感染或人工诱导分子表达），而且通过当前的大多数实验方法制备出的外泌体可能含有内体起源的小型EV（也就是外泌体）和非内体起源的小型EV，以及其他的基于脂质的非囊泡结构（比如多种密度的脂蛋白，即中密度脂蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白）和新鉴定出的外泌颗粒（exomere）。近期，富含晚期内体组分的外泌体被定义为一种带有四跨膜蛋白CD63（一种在MVB中堆积的蛋白）和CD9/CD81（主要存在于质膜上）的小型EV亚型，不过这种定义还需其他的细胞和条件下进行验证。在包括癌症、免疫反应、心血管疾病、再生和干细胞疗法在内的许多病理生理情况下，EV发挥着许多功能。尽管许多研究将这些功能描述为是外泌体特有的，但是人们已发现许多外泌体制备物存在潜在的多种亚细胞起源，这表明多种EV类型具有更广泛的功能相关性。
在一篇新的发表在2019年1月那期Nature Cell Biology期刊上的评论类型文章中，Mathilde Mathieu等人通过一些非详尽的例子讨论了外泌体和源自质膜的EV在生物发生、分泌、将它们的内含物靶向运送到受者细胞中和随后在受者细胞中发挥的功能方面的特异性[1]。
1.在MVB内部或质膜上的囊泡出芽
内体ILV和源自质膜的EV共有的一个重要特征是与在不同区室之间进行运送所需的其他细胞内出芽事件不同的是，它们朝着远离细胞质的方向进行出芽。因此，它们的膜定位与细胞表面的膜定位相同，从而暴露跨膜蛋白的胞外结构域并包围细胞质组分。鉴于已知的EV生物发生、分泌以及与靶细胞之间相互作用的分子机制已在其他地方进行了全面综述[2]，在这篇新的评论类型文章中，Mathilde Mathieu等人描述了在MVB内部囊泡（即未来的外泌体）形成的关键实例，以及这些机制是否以及如何以及如何适用于在质膜上形成的EV（图2）。 （1）ESCRT。转运所需的内体分选复合物（ESCRT）是一个蛋白家族，它们在MVB膜上与一系列复合物（ESCRT-0，ESCRT-I，ESCRT-II和ESCRT-III）结合以便调节分子货物靶向运送到ILV中和ILV形成。在小型EV制备物种存在的TSG101（tumour susceptibility gene 101 protein）和其他的ESCRT蛋白或ESCRT辅助分子，比如ALIX（由PDCD6IP编码）和VPS4（vacuolar protein sorting-associated protein 4），经常被视为它们起源自MVB的证据。然而，ESCRT因子参与质膜上的各种出芽和膜断裂事件，所有这些事件都需要ESCRT-I/II/III和辅助分子，从而导致EV释放。
ESCRT-0组分通常未在质膜出芽和释放模型中描述过。因此，EV分泌的ESCRT-0依赖性可能是证明它们起源自MVB的手段。因此，剔除HeLa细胞中的ESCRT-0组分HRS（由HGS编码）或STAM1（signal transducing adapter molecule 1）会减少携带CD63和MHC-II/CD81的小型EV（对应于外泌体）的分泌。然而，这些方法可能会引起不相关但容易混淆的影响。比如，在HIV病毒感染期间的HRS剔除通过阻止通常在质膜上截留病毒颗粒的tetherin（由BST2编码）降解而减少了从质膜上释放的病毒。鉴于tetherin也将源自MVB的外泌体保留在质膜片（plasma membrane patch）上，这可能还减少外泌体和源自质膜的EV的分泌。HRS结合到蛋白的泛素部分上，从而将蛋白靶向运送到ILV中。
然而，在小型EV中存在的泛素化蛋白并不能支持它们的外泌体性质，这是因为来自质膜来源的EV的泛素化蛋白的缺乏尚未得到证实。相反，在细胞接触1型干扰素后，蛋白随后与泛素样分子ISG15的结合经证实触发MVB-溶酶体融合，从而减少外泌体分泌。然而，鉴于一个至为重要的ISG15靶标是TSG101，而TSG101也是质膜来源的小型EV形成所所必需的，因此在增强的ISG15结合后观察到的分泌体减少可能并不是外泌体所独有的。
（2）脂质。朝着远离细胞质的方向进行出芽的囊泡包括由鞘磷脂酶产生的锥形脂质，如神经酰胺。经证实抑制中性鞘磷脂酶（nSMAse-2，由SMPD3编码）通过一种不依赖于ESCRT的机制阻止MVB中的ILV出芽和外泌体释放。虽然这篇新的文章并未探究它们对其他EV的影响，但是神经酰胺抑制药物（尤其是GW4869）或靶向nSMAse-2的RNA干扰通常用于证实所分析的EV的外泌体性质，和/或一种特定功能依赖于外泌体的性质。然而，影响神经酰胺产生途径会影响许多其他的细胞特性。具体而言，GW4869可通过一种不依赖于nSMAse的机制诱导稍大一些的质膜来源的EV的补偿性分泌或细胞死亡。此外，nSMAse控制着通用的后高尔基体转运（post-Golgi trafficking），因而潜在地控制着所有分泌。神经酰胺还调节可能间接影响MVB稳态的自噬。一般而言，在解释化合物或对基因表达进行调节对EV分泌的影响时，应考虑对细胞死亡和自噬的影响。
在秀丽隐杆线虫中，磷脂酰乙醇胺的外部化导致EV出芽和释放，其中磷脂酰乙醇胺通常通过翻转酶（flippase）维持在质膜的胞质面上。在哺乳动物细胞中，磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺不对称性的丧失也导致质膜来源的囊泡出芽，并且两个具有促翻转酶（scramblase）活性的蛋白家族参与这个过程。然而，这些机制对外泌体分泌的影响尚未被探究过。
（3）多配体聚糖（syndecan）和多配体聚糖结合蛋白（syntenin）。将跨膜蛋白特异性地靶向MVB的ILV中也能够通过蛋白-蛋白相互作用发生。多配体聚糖结合蛋白-1（syntenin-1，由SDCBP编码）在与多配体聚糖-1（syndecan-1）的胞质结构域结合后，招募ALIX，接着与ESCRT-I-III组分一起，允许向内出芽进入ILV中并随后在含有外泌体的沉淀中回收多配体聚糖结合蛋白和多配体聚糖-1。这种机制依赖于Src介导的多配体聚糖-1内吞作用，并且需要磷脂酶D2和ARF6（ADP-ribosylation factor 6, ADP-核糖基化因子6）的GTP酶活性。然而，该途径可能不是所有细胞类型中MVB来源的外泌体特异性的。在树突细胞和脂肪细胞中，多配体聚糖结合蛋白在小型EV（特别是对应于外泌体的那些EV）中最为丰富，但是也在较大的EV中检测到。此外，ARF6也是肿瘤细胞释放的大型EV形成所必需的。
（4）MVB酸化。沿着内吞途径的逐步酸化是内化组分的降解和再循环所必需的。Atg5（Autophagy protein 5, 自噬蛋白5）和Atg16L1将V1-ATPase的E1亚基（由ATP6V1E1编码）解离并因此清除它的质子转运蛋白活性，或者巴弗洛霉素（bafilomycin）处理，均可降低MVB酸化并显示增加人细胞中的外泌体分泌。这表明pH值可能是MVB作为分泌区室（secretory compartment）还是降解区室（degradatory compartment）的决定因素。或者，增加的外泌体分泌可能是由于内吞作用减少和由MVB功能发生改变的细胞分泌的外泌体降解，或者是由于巴弗洛霉素对高尔基体运输的间接影响。
虽然当前关于外泌体MVB中的生物发生的讨论并不详尽，但是需要考虑的一个关键点是在目前已知的生物发生机制中，没有一种机制是完全特异于外泌体途径的，或者在所有细胞类型中都是有效的。
2.外泌体和EV分泌的胞内转运
只要允许MVB转运至质膜并与质膜融合的细胞内转运分子是外泌体分泌所特有的，那么它们也可允许区分外泌体与质膜来源的EV。
（1）Rab GTP酶。Rab家族的小GTP酶成员在胞内区室之间转移囊泡方面发挥了良好的作用，并且还涉及MVB转运到质膜以便释放外泌体。比如，破坏Rab27a或Rab27b会改变MVB形态并及其停靠在质膜上，这表明它们在外泌体分泌中发挥作用。虽然这项研究和随后的研究均未评估操纵Rab27a/b对其他EV分泌的影响，但是单独抑制Rab27a会以一种依赖于MVB的方式降低HIV从质膜中分泌出来。这一观察结果是否也适用于非病毒诱导的质膜来源的EV仍然是不清楚的，但是在理解Rab27抑制的EV相关影响时，这一点是值得考虑的。除了MVB之外，Rab27a/b参与Weibel-Palade 小体和高尔基体来源的分泌颗粒的分泌。因此，正如在剔除Rab27a的肿瘤细胞中对一些可溶性非EV相关蛋白所观察到的那样，Rab27a/b抑制可能影响存在于这些颗粒内的可溶性组分的分泌。基于此，利用Rab27a/b抑制来证实外泌体或小型EV参与其中需要额外的步骤，比如通过外源性的外泌体或小型EV拯救表型。
同样的考虑适用于促进外泌体或小型EV分泌的其他小GTP酶。比如，抑制Rab11a、Rab35或Rab7导致小型EV恢复减少。然而，Rab11和Rab35在早期内体或再循环内体中起作用，从而提高了释放的囊泡来自早期内体或甚至来自质膜的可能性。有趣的是，在细胞毒性T细胞中，Rab27a+晚期内体与Rab11a+再循环内体之间的融合由Rab27a效应物Munc13-4（由UNC13D编码）介导，并且是调节细胞毒性颗粒与质膜之间的融合所必需的。类似地，Rab11a和Rab27a交谈可能参与最近描述的外泌体在人癌细胞系中发生钙离子诱导的Rab11a-Munc13-4依赖性的分泌。总之，这些研究表明细胞类型、环境和对处于稳定状态或诱导时的EV分泌进行的分析（比如，通过钙离子水平增加或其他方式）可能影响小型EV和/或外泌体分泌的机制，因此一种具体的实验条件可能并不适用于其他的实验系统。
（2）SNARE。Rab GTPase可能在比较早的或复杂的细胞内转运步骤中起作用，从而用于调节外泌体分泌。因此，研究外泌体生物发生的一个主要目的是鉴定MVB与质膜融合所特别需要的SNARE复合物。人们已发现YKT6 SNARE是携带Wnt的外泌体分泌所必需的，并且据报道Syx-5（秀丽隐杆线虫中的一种与syntaxin-5存在同源关系的蛋白）通过Ral-1小GTP酶将MVB靶向质膜。然而，鉴于这两种SNARE都涉及内质网-高尔基体转运，对它们的抑制也必然会影响正常的分泌途径。
特别地，科学家们已发现作为一种神经元特异性的参与突触小泡分泌的SNARE，syntaxin-1A影响果蝇中的外泌体分泌。在HeLa细胞中，在组胺处理后，作为一种质膜相关的SNARE，SNAP-23（synaptosomal-associated protein 23, 突触体相关蛋白23）自发地介导MVB-质膜融合。尽管这些SNARE参与更靠近质膜的融合事件因而可能不会干扰上游转运，但是它们也可能参与分泌颗粒的分泌。
在细胞水平上可视化观察MVB运输和EV释放也可区分分泌途径和降解途径。比如，联合使用pH敏感性的荧光CD63构建体和光电关联显微镜（correlative light-electron microscopy），允许对MVB与质膜之间的融合进行明确的可视化观察和定量分析。然而，该途径与直接质膜出芽或与较弱酸性的区室之间的融合的相应贡献是无法确定的，这是因为后面的事件不能通过这种类型的pH敏感性的实验系统来加以量化。
（3）细胞骨架。EV的出芽和释放需要在质膜下发生变化的肌动蛋白聚合以及随后在由小GTP酶RhoA精心协调的过程中发生的肌动蛋白细胞骨架收缩。然而，人们尚未探究MVB周围的肌动蛋白池（actin pool）的状态及其对ILV形成的潜在影响。皮质肌动蛋白的解聚也可能是允许MVB停靠在质膜上以便外泌体的随后释放所必要的。
因此，靶向肌动蛋白聚合可间接地促进外泌体分泌。类似地，这种微管网络很可能是将MVB转运到质膜上所必需的；然而，尽管对它进行药物抑制会降低外泌体分泌，但是它也影响其他的质膜来源的结构域，比如纤毛或纳米管。因此，尽管细胞骨架成分可能在分泌外泌体还是质膜来源的EV中起重要作用，但是靶向它们也可能诱导多种非特异性的作用。
3.包膜病毒与外泌体和其他的小型EV相比较
包膜病毒出芽与小型EV的生物发生有许多相似之处。病毒在病毒颗粒组装和出芽的不同步骤中使用宿主细胞内运输机制，而对EV而言，这些步骤可能根据病毒和宿主细胞的不同在不同位置发生。在HIV-1中，病毒组装发生在T细胞的质膜上，而在巨噬细胞中，它发生在内部区室中。在膜出芽部位招募HIV-1 Gag蛋白对于病毒组分的最终组装是必需的。Gag还会招募ESCRT复合物，包括TSG101和ALIX，它们最终通过膜裂变事件介导新生颗粒的释放。Gag的核衣壳结构域能够模拟多配体聚糖结合蛋白的PDZ结构域来捕获ALIX，这就使得多配体聚糖结合蛋白能够在HIV-1出芽期间替代核衣壳功能。
与大型EV和含有多配体聚糖结合蛋白的外泌体相比，HIV-1出芽并不依赖于ARF6 GTP酶，但它还涉及许多已知也促进EV分泌的Rab蛋白，包括Rab9、Rab7a、Rab27a、Rab14和Rab11-FIP1C。Rab14是个例外，它在EV调节中的潜在作用仍有待研究。SNARE也参与HIV和EV释放。对SNARE机制的抑制证实它在Gag蛋白定位到质膜上发挥作用，因此，也在HIV-1装配中发挥作用；然而，尚未确定的是一些SNARE是否是EV特有的而不影响HIV。最后，HIV-1组装涉及丝状肌动蛋白结构的形成，这种结构会在病毒出芽后消失。虽然干扰肌动蛋白的药物会减少病毒产生，但是如前所述，它们也可能影响EV的释放。由于这些过程的许多方面仍然在很大程度上是未知的，因此有必要鉴定和描述调节EV和病毒产生的特定步骤的各个分子。
HIV-1病毒的直径大约为120nm，与外泌体和小型EV的直径相当。这些膜包围结构还具有其他的物理和分子特征。比如，HIV-1病毒颗粒和小型EV的脂质组合物包括高比例的胆固醇、鞘磷脂和饱和脂质，并且它们都具有相同的膜定位。HIV-1病毒颗粒膜也富含CD63和CD81四跨膜蛋白，其中这两种四跨膜蛋白存在于小型EV上。这些相似性使得将病毒颗粒和EV与受到病毒感染的细胞分离开来特别具有挑战性。比如，小型EV和HIV-1病毒颗粒在蔗糖密度梯度中达到相同的平衡密度。更为复杂的是，受到病毒感染的细胞产生经过修饰的整合着病毒基因组片段和病毒蛋白的EV，这意味着经典的纯化技术导致这些组分共纯化。因此，在HIV-1感染期间对小型EV功能的研究受到难以获得不含HIV的EV制备物的阻碍，这可能解释存在相互矛盾的关于诱导前病毒EV反应和抗病毒EV反应的报道。
4.EV摄取的生物学机制及其发挥的功能的例子
对EV兴趣的增加与它们引发受者细胞表型变化的能力有关。EV尺寸和/或表面组分的差异很可能影响靶细胞对它们的识别和捕获。比如，微胞饮（micropinocytosis）在理论上能够捕获分离的外泌体和小型EV，但是不能捕获太大的EV或小型EV聚集体。鉴于人们才开始意识到EV的多样性，因此在它们到达受者细胞后，人们对不同EV亚型的命运的了解仍然有限。因此，在这篇评论性文章的这一部分，Mathilde Mathieu等人将讨论一般的EV摄取机制及其相关功能。
EV能够通过在细胞表面起作用而将信息传递给受者细胞，而不用传送它们的内含物。比如，在免疫反应期间，携带MHC-肽复合物的EV可激活T细胞上的同源T细胞受体。EV也能够被内化，随后要么靶向到溶酶体中用于降解，要么进入再循环并释放到胞外空间。在受者乳腺癌细胞内的这种类型的EV再循环使得Wnt11与内化的来源自成纤维细胞的CD81+ EV相结合。这表明这些颗粒的再释放通过Wnt相关的信号转导触发乳腺癌细胞迁移。
然而，EV的主要特征是包围和传送受到脂质双层保护的分子。许多研究报道了EV分子货物全部运送的影响。下面将通过选定的例子说明这一点。一些报道证实EV在肿瘤进展中发挥作用，比如，通过交换胶质母细胞瘤细胞和内皮细胞之间的RNA，和交换成神经管细胞瘤细胞和内皮细胞之间的致癌DNA序列和反转录转座子元件，以及交换胶质瘤细胞之间的蛋白，如致癌性的表皮生长因子受体变体III（EGFRvIII）。在神经系统中也报道了蛋白的转移，在那里，EV介导的胞质突触结合蛋白4（cytosolic synaptotagmin 4）从突触前细胞转移到突触后细胞，从而允许逆向控制突触前活动。在另一种情形下，将有毒成分（比如朊病毒的瘙痒病形式，即PrPsc）装载到EV中，从而扩散到正常细胞中。此外，HIV-1传播和增殖所需的趋化因子受体CCR5可通过EV在单核细胞和内皮细胞之间进行交换，从而导致通常不具备病毒感染所需的这种受体的组织遭受感染。摄取EV和将它的分子货物运送到受者细胞的细胞质中的机制仍未完全得到描述，如图3所示。
图3.受者细胞摄取EV的三个步骤。
EV摄取的第一步涉及靶向受者细胞。然而，EV亚型和受体细胞的特定组合是否赋予靶向特异性或该过程是否是非特异性还是随机性的仍然未得到解决，而且现有文献对这两种可能性都提供了支持。比如，由少突胶质细胞分泌的小型EV优先内化到小胶质细胞而不是神经元中。来自原代神经元的小型EV仅被其他的神经元捕获，然而来自神经母细胞瘤细胞系的小型EV同样地结合星形胶质细胞。相比之下，正如针对经过亲脂性染料或荧光性的CD63广泛标记的EV开展的实验所证实的那样，HeLa细胞能够摄取由不同细胞产生的各种EV，而且这似乎适用于各种细胞类型。为一种通用的靶向过程提供进一步支持的是，EV介导的分子货物转移能够在物种间环境（小鼠和人类）发生。然而，至于组合使用EV和细胞类型是否可能实现生理学相关的特异性靶向，这仍然有待阐明。CD47是一种保护细胞免受吞噬作用的整合素相关蛋白，通常在EV的表面上发现，并且通过阻止巨噬细胞和单核细胞的吞噬作用，增加EV在血液中的循环时间。这导致这些EV更有效地靶向胰腺细胞以便运送人工装载的短干扰RNA（siRNA），这表明细胞靶向也可能通过一种阴性选择机制得以实现。鉴定EV的生理靶标以及这些靶标对于特定EV亚型如何可能存在不同将在选择实验模型和开发新的测定方法方面提供巨大优势。
EV摄取的第二步是进入受体细胞的入口点。虽然大多数研究报道了受者细胞对EV的内化，但是这是通过一种非特异性过程（比如巨胞饮或微胞饮），还是通过一种特定的受体依赖性途径发生，仍然是不清楚的。定位于EV和受者细胞表面的许多蛋白，包括整合素、凝集素/蛋白聚糖、T细胞免疫球蛋白和Tim4（mucin domain-containing protein 4, 含有粘蛋白结构域的蛋白4）已被提出参与EV摄取，因此它们也可能导致细胞靶向特异性。然而，没有一种蛋白是通过证实它是EV内化所充分必要的而被确定为真正的EV受体。许多EV亚型具有相同的表面蛋白，并且它们中的一种蛋白可能充当受体的一般配体，从而使得囊泡得以内化，这类似于低密度脂蛋白的摄取机制。
到目前为止，据报道EV内化通过多种途径发生，这些途径涉及网格蛋白依赖性途径和网格蛋白非依赖性途径的内吞作用。人们对EV功能的这一方面也缺乏共识。比如，科学家们已提出参与网格蛋白非依赖性内吞作用的小窝蛋白1（caveolin 1）在相对相似的实验装置中对EV摄取具有负面影响和正面影响。这种摄取途径可能更依赖于受者细胞类型而不是EV本身，这是因为在大多数研究中，EV通过使用通用亲脂性染料被广泛追踪。
EV摄取的第三步也是最后一步是将它的内含物运送到受者细胞中。许多研究没有评估EV内化的终点（比如，是内含物运送，还是EV降解或再分泌），这阻碍了针对EV介导的分子货物转移的功能性后果作出结论。然而，人们已提出质膜作为通过膜融合运送内含物的靶膜。对质膜来源的能够运送DNA的EV而言，可能就是这种情形，这是因为它们较大的尺寸可能限制了它们的内化。尽管这种机制不能够正式地加以排除，但是大多数出版物都报道在运送分子货物之前，EV通过内化进入细胞中。因此，人们猜测内体是运送EV内含物的位置，作为对酸性pH作出的反应，膜融合已被提出是一种潜在的机制，这类似于一些病毒所使用的这个过程。脂质，比如胆固醇和磷脂酰丝氨酸，可能也在膜融合中发挥作用。比如，已有报道指出膜联蛋白V（annexin V）结合暴露于某些EV表面上的磷脂酰丝氨酸，阻断来源自单核细胞的EV和活化的血小板之间的融合。然而，许多EV在它们的表面上并不含有磷脂酰丝氨酸，这表明其他分子参与其中。EV拓扑结构表明它们与质膜或内体膜之间的融合将需要一种不同于用于胞内囊泡之间融合的SNARE蛋白的特定机制。可能控制EV从内体中逃逸出去的其他机制也不能够加以排除，比如通过释放来自破裂的内体或溶酶体区室的受到部分降解的材料。此外，人们已描述了一些意想不到的运送机制，包括通过这些区室与含有内化EV的内体的接触直接转移到细胞核或内质网中。这些观察结果等待进一步研究，但提出了关于EV特异性胞内命运的有趣可能性。
5.结论
过去十年的一个重大进步是人们越来越认识到EV包括许多不同的颗粒亚型，而且每种颗粒亚型在细胞间通信中都可能具有有趣的功能。尽管人们对这一领域的兴趣日益浓厚，但对控制EV生物发生、释放、摄取和功能的细胞和分子机制的理解仍然是有限的。精确描述EV的一个关键限制是分离和描述纯的特定颗粒亚型存在技术难度，这是因为人们当前所使用的方法导致对不同亚细胞来源的EV进行系统性共分离。因此，尽管许多文章使用术语“外泌体”来指代通过物理过程与较大的EV分离开来的EV制备物，但它们很可能是指外泌体性质和非外泌体性质的小型EV的混合物。因此，除非明确确定它们的MVB来源，不然可能最好支持通用术语“小型EV”。
人们当前对EV生理学、多样性、内化和分子货物运送的了解仍然非常有限，因而无法准确地得出关于EV如何与受者细胞相互作用并对它们进行修饰的机制得出结论。为了让EV领域取得进展，有必要以综合的方式进行研究，包括分子、细胞和功能表征，从而尽可能地比较一种给定实验系统中的不同EV亚型。这些方法对于确定哪些分子或机制对某些EV亚型是特异性的，哪些是适用于所有EV亚型的至关重要。
一个受益于进一步研究的特定领域是EV摄取。目前针对EV或一种给定的EV亚型将内含物运送到受者细胞的细胞质中的主要途径，还没有达成共识。确定内化是否通过巨胞饮或微胞饮和/或受体介导的途径进行发生，以及这些过程是否导分子致货物运送对于理解和控制EV摄取是至关重要的。一种合适的方法可能是首先跟踪存在于许多不同EV类型中存在的通用可溶性分子货物，以便确定分子货物交换具有显著的生理和生化作用的条件（包括供者细胞和受者细胞组合）。这些知识将允许描述EV摄取和内含物运送的细胞和分子基础。考虑各种生物发生、释放和摄取途径如何影响与EV无关的胞内功能也很重要。这样的系统性分析将有助于在生理和病理环境中鉴定特定EV功能，并且将有助于将这些知识转化为对EV病理效应的治疗或EV相关细胞机制在治疗上的应用。
参考文献：
1. Mathilde Mathieu et al. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology, January 2019, 21(1):9–17, doi:10.1038/s41556-018-0250-9.
2. Van Niel et al. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2018, 19, 213–228.
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