电穿孔法应用高压电击短暂或稳定地将DNA导人细胞,是一种目前大受好评的方法。它适用于多数类型的细胞,既可产生高频率的稳定转染,又可产生短暂的基因表达,并且由于其所需步骤甚少,因而比其他技术更为容易
实验材料 | 原生质体细胞 |
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试剂、试剂盒 | 电穿孔缓冲液原生质溶液 |
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仪器、耗材 | 尼龙筛网锥形管 |
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实验步骤 | 1. 将小心切成5 mm 的条状无菌植物材料8 ml 原生质体溶液中温育,置于30℃旋转摇床上3~6 h。从中获取原生质体细胞。
2. 经80 μm 的尼龙筛网滤过除去沉渣,用4 ml 电穿孔缓冲液淋洗筛网。将原生质体细胞并入一个无菌的15 ml 锥形离心管中。
3. 300 g 离心5 min,弃上清。加5 ml 植物电穿孔缓冲液,重复洗涤步骤。按1.5×106~2×106细胞/ml 的密度将原生质体细胞重悬于植物电穿孔缓冲液中。
4. 同哺乳动物细胞一样进行电穿孔转染。开始时可用1~2 KV电圧及3~25 μF电容进行1次或几次电冲击,然后可在此基础上继续优化该体系。 5. 培养48 h 后收集细胞,提取RNA,进行短晳基因表达分析,或选择稳定转化的细胞。
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