RNA 聚合酶DNase I蛋白酶 KRNA 酶抑制剂RNA 酶消化混合液载体 RNA核糖核苷酸标准 RNA待测 RNAUTP核糖核酸探针

乙酸铵DTT杂交缓冲液苯酚氯仿RNA 凝胶加样缓冲液SDS乙酸钠TE转录缓冲液三氯乙酸聚合酶稀释缓冲液

变性的聚丙烯酰胺凝胶水浴Whatman 3 MM 滤纸或类似物

一、材料

1. 缓冲液和溶液

乙酸铵（10 mol/L）

DTT ( 0.2 mol/L)

杂交缓冲液（用于 RNA)（40 mmol/L PIPES (pH 6.8)，1 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，0.4 mol/L NaCl，80% 去离子甲酰胺，使用 PIPES 的二钠盐，用 1 mol/L 的盐酸调节 pH。）

苯酚：氯仿（1:1，V/V）

RNA 凝胶加样缓冲液（95% 去离子甲酰胺，0.025% （m/V）溴酚蓝，0.025% （m/V）二甲苯腈蓝 FF，5 mmol/L EDTA（pH 8.0），0.025% （m/V）SDS）

SDS ( 10% m/V)

乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2)

TE ( pH 7.6)

10X 转录缓冲液（0.4 mol/L Tris-Cl( pH 7.5 )，0.1 mol/L NaCl，60 mmol/L MgCI₂，20 mmol/L 亚精胺，-20℃ 分装保存）

三氯乙酸（1% 和 10% TCA)

2. 酶和缓冲液

噬菌体编码的依赖 DNA 的 RNA 聚合酶

DNase I ( 1 mg/ml，无 RNase 的胰 DNase)

聚合酶稀释缓冲液

蛋白酶 K ( 10 mg/ml)

RNA 酶抑制剂，置冰上

RNA 酶消化混合液（300 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.4)，5 mmol/L EDTA（pH 7.5)，40 μg/ml RNase A，2 μg/ml RNase T1，用 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.5 )，15 mmol/L NaCl 制备 10 mg/ml RNase A (小牛胰 RNaae)，用 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.5 )，15 mmol/L NaCl 制备 1 mg/ml RNase T1，凝胶）

变性的聚丙烯酰胺凝胶（含 8 mol/L 尿素）

3. 核酸和寡核苷酸

载体 RNA (1 mg/ml）

用于模板制备的质粒 DNA 或线性靶 DNA

核糖核苷酸

标准 RNA

待测 RNA

UTP (100 μmol/L)

4. 探针

核糖核酸探针

5. 放射活性成分

[α-³²P] UTP（10 mCi/ml，800 Ci/mmol）

6. 专用设备

预置到 30℃，85℃，95℃ 和合适复性温度的水浴

Whatman 3 MM 滤纸或类似物

二、方法

制备随机标记的单链 RNA 探针

1. 制备线性 DNA 模板

(1) 从质粒 DNA 制备模板

① 用 5 倍过量的适当的限制性内切核酸酶切割克隆的 DNA 序列内部或下游使 5~20 μg 质粒线性化。线性化后形成的末端与启动子距离应为 200~400 bp。确保所使用的限制酶不直接使启动子与目的序列分离。因为噬菌体编码的 RNA 聚合酶需 3' 末端起始转录，所以选择能产生平末端或 5' 突出端的限制酶。

② 消化反应后，取少量反应液用琼脂糖凝胶电泳分析。确保无痕量的环状质粒可见，否则，加入适量的酶继续消化直到检测不到环状质粒为止。

③ 酚：氯仿抽提两次纯化线形 DNA，再利用乙醇沉淀。沉淀用 70% 乙醇洗涤，pH7.6 的 TE 溶液溶解，浓度为 1 μg/μl。

(2) 靶 DNA 扩增制备模板

① 用 PCR 扩增长度为 100~400 bp 的双链 DNA 模板（Schowalter and Sommer 1989; Bales et al.1993; Davis et al. 1997)。

② 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 PCR 扩增产物以确保片段大小正确。

③ 酚：氯仿抽提两次纯化线形 DNA，再利用乙醇沉淀。沉淀用 70% 乙醇洗涤， pH 7.6 的 TE 溶液溶解，浓度为 1 μg/μl。

2. 按顺序混合下列溶液，除特殊说明的预热至室温。

0.5 μg 线性的 DNA 模板

1 μl 0.2 mol/L DTT

2 μl 核酸溶液

1 μl 100 μmol/L UTP

50~100 μCi [α-³²P] UTP（10 mCi/ml，800 Ci/mmol）

补水至 16 μl

2 μl 10X 转录缓冲液

24 单位 RNA 酶抑制剂（冰上）

15~20 单位噬菌体 RNA 聚合酶（冰上）

室温下按顺序加入上述试剂既可防止 DNA 被转录缓冲液中的亚精胺和 Mg²⁺ 沉淀，又可防止 RNA 酶抑制剂被高浓度的 DTT 失活。

将上述混合液 37℃ 保温 60 min。

3. 上述反应结束时，加入 1 单位不含 RNA 酶的 DNA 酶约 1 μg，继续 37℃ 保温 10 min。

4. 用 TE 缓冲液（pH 7.6) 稀释反应液至 100 μl，取 1 μl 测量总放射活性和可被 TCA 沉淀的放射活性。通过掺入的可被 TCA 沉淀物质的放射活性比例，计算反应合成的 RNA 探针重量和特异性活性。

5. 第 4 步溶液移取 1 μl 后，在剩余稀释反应液中加入 10 μl 1 mg/ml 载体 RNA。酚: 氯仿抽提反应液，将水相移至一新管，加入 10 μl 10 mol/L 乙酸铵 300 μl 乙醇沉淀 RNA。贮存于 -20℃ 直到第 4 步完成。

6. 4℃ 高速离心 10 min 回收 RNA。75% 乙醇洗涤，再次离心。弃上清，室温干燥 RNA 直到无痕量乙醇可见。若探针需凝胶电泳进一步纯化（步骤7），则用 20 μl 胶加样缓冲液稀释沉淀的 RNA，否则，用 20 μl TE 缓冲液（pH 7.6 ) 稀释沉淀的 RNA。

7. 用预先准备的含有 8 mol/L 尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化探针。高特异性活性的探针应在近期使用，以避免 RNA 的放射化学损伤。

8. 将待测的每种 RNA 和标准 RNA 核酸探针合并（2X10⁵~10X10⁵ cpm，0.1~0.5 ng) 。加入 0.1 倍体积 3 mol/L 乙酸钠 (pH 5.2）和 2.5 倍体积冰乙醇。将混合物贮存于 -20℃ 10 min，4℃ 高速离心 10 min 回收 RNA。75% 乙醇洗涤沉淀。小心弃去乙醇，室温干燥沉淀直到乙醇完全蒸发。

9. 用 30 μl 杂交缓冲液溶解 RNA。多次上下吹打溶液以保证沉淀彻底溶解。


10. 杂交混合液在 85℃ 保温 10 min 使 RNA 变性，然后迅速将其转移至设置在复性温度的保温器后或水浴中，保温 8~12 h。

11. 将杂交混合液冷却到室温，加入 300 μl RNA 酶消化混和液，30℃ 消化 60 min。

12. 加入 20 μl 10% SDS 和 10 μl 10 mg/ml 蛋白酶 K 终止反应。反应混合液 37℃ 保温 30 min。

13. 加入 400 μl 酚: 氯仿，剧烈震荡 30 s, 室温离心 5 min 分相。

14. 将上相移至新管，小心避免接触两相中间界面。

15. 加入 20 μg 载体 RNA 和 750 μl 冰乙醇。将溶液混合并 -20℃ 放置 30 min。

16. 4℃ 高速离心 15 min 回收 RNA。小心弃去乙醇，用 500 μl 170% 乙醇洗涤沉淀。再次离心。

17. 小心弃去乙醇，室温干燥直到痕量乙醇蒸发。

凝胶电泳分析抗 RNA 酶的杂交体

18. 用 10 μl 凝胶加样缓冲液重悬沉淀。

19. 95℃ 加热核酸 5 min，迅速置冰上。短暂离心使样品收集在管底。

20. 利用含 8 moI/L 尿素的聚丙烯酰胺薄胶电泳分析标记的核酸。

21. 当示踪染料在胶中迁移至合适距离后，关掉电源，拆除电泳装置。轻轻撬开大玻璃板一角，慢慢从胶上移开大玻璃板。切掉胶的一角以辨别方向。

22. 将带有胶的玻璃板移到装有过量的 10% TCA 的托盘中。轻轻在室温下摇动或旋转托盘 10 min。

23. 倒掉 10% TCA 溶液并代之以过量的 1% TCA。轻轻在室温下摇动或旋转托盘 5 min。

24. 倒掉 1% TCA 溶液，用蒸馏的去离子水淋洗固定过的胶。将玻璃板连同胶从托盘中取出放于平板上。用纸从胶边缘吸走多余的水分。

25. 割取一张比胶边缘大 1 cm 的 30 MM 滤纸，将其置于胶上，将玻璃板倒转。

26. 拿开玻璃板，将胶放到凝胶干燥器中 60℃ 干燥 1~1.5 h。

27. 建立胶的自显影影像。通过密度计量学或磷光摄影扫描，也可以切下胶中含有相应片段的部分，利用液闪仪计数。