用Sep-Pak C18柱层析法纯化放射性标记的寡核苷酸实验

离心干燥机微量离心管放于管架或收集器Sep-Pak 经典层析柱注射器

材料

溶液和缓冲液
稀释贮存液至适当浓度。

乙腈（5%、30% 和 100%)
毎个 Sep-Pak C18 柱用 10 ml 髙效液相（HPLC) 级乙腈（100%), 使用前用水稀释乙腈。

碳酸氢铵（25 mmol/L,pH8.0)

含 5%(WV) 乙腈的碳酸氢铵（25 mmol/L，pH8.0)
将 5 ml 乙腈与 95 ml25 mmol/L 碳酸氢铵混合

TE 溶液（pH7.6）

核酸与寡核苷酸

放射性标记寡核苷酸

用于纯化的原料是方案 2(步骤 3 或步骤 5）的反应混含液，并已在 68°C 加热灭活噬菌体 T4 多核苷酸

专用设备

离心干燥机（Savant Speed Vac 或相应仪器)

微量离心管（1.5 ml) 放于管架或收集器
用于收集层析柱纯化的放射性标记寡核苷酸洗脱液

Sep-Pak 经典层析柱，短柱身
毎一 Sep-PBk 经典层析柱（可从 Millipore 公司的 Waters 部门购买）含有 360 mg 疏水反相层析树脂（C18）。纯化是利用寡核苷酸在溶剂（水溶液）极性较大时与树脂结合，而在熔剂（如甲醇与水混合液) 极性较小时脱落的原理。每一次磷酸化反应需要一个分离柱。

注射器（10 ml 聚丙烯注射器）

方法

1.Sep-Pak Cl8 反相层析柱准备如下：

a. 将装有 10 ml 乙腈的聚丙烯注射器连接于 Sep-PakC18 经典层析柱。

b. 用注射器缓慢冲洗层析柱。

c. 先将注射器与层析柱分离，再将注射器的柱芯抽出注射器针简，这样可以防止空气抽入层析柱内。将注射器针筒再连于层析柱上。

d. 用 10 ml 过滤无菌水洗去有机溶剂，共 2 次，每次冲洗后均重复步骤 c。

2. 用无菌水将放射性标记的寡核苷酸稀释至 1.5 ml, 并将全部样品用注射器推入层析柱。

3. 用下列四种溶液冲洗层析柱，每次冲洗后重复步骤 1c。

10 ml 25 mmol/L 碳酸氢铵（pH8.0)
10 ml 25 mmol/L 碳酸氧铵/5% 乙腈
10 ml 5% 乙腈
10 ml 5% 乙腈

4.3 份 lml30% 乙腈洗脱放射性标记的寡核苷酸，用 1.5 ml 微量离心管分别收集每个组分，每次洗脱后重复步骤 lc。
警惕：磷酸化反应常常使用大于 100uCi 的放射性标记 ATP, 因此这些层析组分的放射性剂量可能相当可观。应小心、谨慎处理未摻入的放射性物质、移液器吸头及微量离心管。

5. 用离心干燥机干燥含寡核苷酸的溶液（Savant SpeedVac 或相应仪器）。

6. 将放射性标记的寡核苷酸溶于小体积（10ul) 的 TE(pH7.6)。