Northern blot实验（二）

总RNA样品或mRNA样品探针模板DNA(25 ng)尼龙膜

NorthernMax Kit（Cat. # 1940AmbionInc.）琼脂糖DEPCX光底片底片暗盒Random PrimerdNTP Mixture111 TBq mmol[a-32P]dCTPExo-free Klenow Fragment和10 X BufferSephadex G-50SDS双氧水灭菌水

恒温水浴箱电泳仪凝胶成像系统真空转移仪真空泵UV 交联仪杂交炉恒温摇床脱色摇床漩涡振荡器分光光度计微量移液器电炉（或微波炉）离心管烧杯量筒三角瓶

一、用具的准备
 

1.  180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。
 

2.  电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。
 

3.  处理DEPC水(2 L)备用。
 

二、用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染
 

用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。
 

三、制胶
 

1.  称取0.36 mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4 ml DEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分)。
 

2.  在通风厨中加入3.6 ml的10*Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。
 

注意尽量避免产生气泡。
 

3.  将熔胶倒入制胶板中，插上梳子
 

如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。注：胶的厚度不能超过0.5 cm。
 

4.  胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1 cm，小心拔出梳子。（配制250 ml 1*MOPS Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer。）
 

5.  检查点样孔。
 

四、RNA样品的制备
 

在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB（终浓度为10 ug/ml）。混匀后，65℃空气浴15 min。短暂低速离心后，立即放置于冰上5 min。
 

五、电泳
 

1.  将RNA样品小心加到点样孔中。
 

2.  在5 V/cm下跑胶（5ｘ14 cm）。在电泳过程中，每隔30 min短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝（500 bp）接近胶的边缘时终止电泳。
 

3.  紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。
 

注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。
 

六、转膜
 

1.  用3%双氧水浸泡真空转移仪后，用DEPC水冲洗。
 

2.  用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用DEPC水冲洗二次。
 

3.  连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜（膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5 mm），膜在Transfer buffer浸湿5分钟后，放置在多孔渗水屏的适当位置。
 

4.  盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。
 

5.  将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2 mm，以防止漏气。
 

6.  将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。
 

7.  打开真空泵，使压强维持在50~58 mbar；立即将transfer buffer加到胶面和四周。每隔10 min在胶面加上1 ml transfer buffer，真空转移2小时。
 

8.  转膜后，用镊子夹住膜，于1x MOPS Gel Running buffer中轻轻泡洗10秒，去除残余的胶和盐。
 

9.  用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于UV交联仪中自动交联。
 

10.  将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)。
 

11.  将膜在-20℃保存。
 

七、探针的制备
 

1.  在1.5 ml离心管中配制以下反应液：

模板DNA(25 ng) ：1ul

Random Primer ：2ul

灭菌水： 11ul

总体积：14ul
 

2.  95°C加热3分钟后，迅速放置于冰冷却5 min。
 

3.  在离心管中按下列顺序加入以下溶液：

10×Buffer ：2.5 ul

dNTP Mixture ：2.5 ul

111 TBq/mmol[a-32P]dCTP ：5 ul

Exo-free Klenow Fragment ：1 ul
 

4.  混匀后（25 ul），37°C下反应30分钟。短暂离心，收集溶液到管底。
 

5.  65°C加热5 min使酶失活。
 

八、探针的纯化及比活性测定
 

1.  准备凝胶：将1g凝胶加入30ml的DEPC水中，浸泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。换用新配制的TE（PH7.6）。
 

2.  取1ml一次性注射器，去除内芯推扞，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填Sephadex G-50凝胶。
 

3.  将注射器放入一支15ml离心管中，注射器把手架在离心管口上。1600g离心4分钟，凝胶压紧后，补加Sephadex G-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml刻度处。
 

4.  100ul STE缓冲液洗柱，1600g离心4min。重复3次。
 

5.  倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的1.5ml离心管置于管中，再将装填了Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准1.5ml离心管。
 

6.  将标记的DNA样品加入25 ul STE，取出0.5ul点样于DE8　paper上，其余上样于层析柱上。
 

7.  1600g离心4min，DNA将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中。取0.5ul己纯化的探针点样于DE8-paper.
 

8.   测比活性(试剂比活要求:10^₆cpm/ml）。
 

九、预杂交
 

1.  将预杂交液在杂交炉中68℃预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。
 

2.  加入适当的ULRAhyb到杂交管中(以100cm² 膜面积加入10 mlULRAhyb杂交液)，42℃预杂交4 h。
 

十、探针变性
 

1.  用10 mM EDTA将探针稀释10倍。
 

2.  90℃热处理稀释后探针10 min后，立即放置于冰上5 min。
 

3.  短暂离心，将溶液收集到管底。
 

十一、杂交
 

1.  加入0.5 ml ULTRAhyb到变性的探针中，混匀后，将探针加到预杂交液中。
 

2.  42℃杂交过夜（14~24 h）。

杂交完后，将杂交液收集起来于－20℃保存。
 

十二、洗膜
 

1.  低严紧性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 (100 cm²膜面积加入20ml洗膜溶液)，室温下，摇动洗膜5 min两次。
 

2.  高严紧性洗膜： 加入High Stringency Wash Solution#2 (100 cm²膜面积加入20ml洗膜溶液)，42℃ 摇动洗膜20 min两次。
 

十三、曝光
 

1.   将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥。
 

2.   检查膜上放射性强度，估计曝光时间。
 

3.  将X光底片覆盖与膜上，曝光。
 

4.   冲洗X光底片，扫描记录结果。
 

十四、去除膜上的探针

将200 ml　0.1%SDS（由DEPC水配制）煮沸后，将膜放入，室温下让SDS冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。
 

十五、杂交结果
 

操作应该小心，但不必紧张。用于RNA电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去RNAse 酶，以免样品的降解。转膜时，注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡。