mRNA的提取及纯化实验——亲和柱层析法

mRNA

十二烷基肌氨酸钠EDTANaClTris-HCl洗脱液SDS

1.  DEPC处理层析柱。

2.  0.1 M NaOH处理Oliga(dT）－纤维素。

3.  用1×上样液洗柱至pH< 8.0。

4.    无菌水溶解RNA，65℃温浴5分钟后，迅速冷却至室温，加等体积2×上样液，上样，分部收集。

5.  1倍体积1×上样液洗柱，分部收集。

6.  OD₂₆₀沉淀收集液，确定收集液的该值是否接近0，如该值仍很大，则上样液继续洗柱，直至该值接近0。

7.  2~3倍柱床体积的洗脱液，洗柱，分部收集。

8.  测定各收集管的OD₂₆₀，将有吸光值的各管合并。

9.  在洗脱液中加入0.1体积的NaAC，1体积的异丙醇，-20℃沉淀过夜，12 000 g 离心10 min，75%乙醇洗沉淀，真空干燥。

10.  提取mRNA质量的分光光度计检测，将所提mRAN分别在260，280 nm 比色，要求A.  OD₂₆₀%/ OD₂₈₀%不小于2.0及40 μg 所提样品在OD₂₆₀%的值为1 。

11.  提取mRNA质量的电泳检测，在1%的变性胶上，EB染色后，mRNA应在0.5-8 Kb 间均匀着色，1.5-2 Kb 间着色较强。