3.1.3 合成 5＇加帽转录物

一材料与设备

1)DEPC：处理的水

2) 转录缓冲液（5X):200 mmol/LTris-HCI(pH7.9),30 mmol/LMgCl2,lOmmol/L. 亚精胺，50 mmol/LNaCl

3)lOOmmol/LDTT

4)RNasin

5)rATP,rCTP，rUTP，各 2.5 mmol/L

6)rGTP0.5 mmol/L

7)m⁷ G(5＇)ppp(5＇)G,5 mmol/L

8)DNA 模板，1〜2 mg/ml

9)RNA 样品缓冲液：10 mmoL/I. 去离子甲酰胺，3.5 ml37% 甲醛，2 mlMOPS 缓冲
液

10)RNA 载样缓冲液:50% 甘油，lmmol/LEDTA，0.4% 溴酚蓝,lmg/ml 溴化乙锭

11)MOPS 缓冲液：0.2 mmol/LMOPS(pH7.0),50 mmol/L 乙酸钠,5 mmol/LEDTA(pH8.0)

12)TE 缓冲液


二操作方法

1) 体外转录生成 RNA

在无菌离心管中，室温下加入下述成分:

5X 转录缓冲液                                                4ul

100 mmol/LDTT                                              2ul

RNasin20U

rATP,rUTP,rCTP(各 2,5 mmol/L)                        4ul

GTP(O.5 mmol/L)                                            2ul

m⁷ G(5＇)ppp(5＇)G(5 mmol/L)                         2ul

DNA 模板 (1〜2 mg/ml)                                   1-2ug

加无核酸酶的水至终体积                                  19ul

2) 起始反应加入 1ul SP6、T7 或 T3RNA 聚合酶（15〜20U/ul)。

3)37〜40℃ 孵育 60 min。

4) 按 RNA 标准转录反应所述的方法除去 DNA 模板，纯化 RNA 转录物。