同时检测包含成百上千种基因的 RNA 水平，从而构建一个详细的基因表达谱是分子生物学新的一项激动人心的本领。这是通过将 mRNA 定量扩增并用生物素标记再与 DNA 芯片杂交实现的，芯片上预先固定有与目的 mRNA 互补的寡核苷酸序列。
来源：《精编分子生物学实验指南 第五版 第二十一章》
| 实验方法原理 | 扩增步骤完全决定于干净、完整的起始 RNA。对培养的细胞，作者采用胍盐裂解再用树脂纯化（如 Qiagen RNeasy Kit）的方案。 扩增 mRNA 可从 Poly（A）＋或总 RNA 开始。尽管 poly（A）＋灵敏度更高，因为除 掉了 cDNA 反应期间大部分与 rRNA 的错配，而使用总 RNA 起始则可以分析那些细 胞或组织有限的生物系统。使用总 RNA 起始一个重要的修正是将 cDNA 第一链合成的温度从 37℃ 提高到 50℃。探针选择严格限制在编码区最后的 600 个碱基；除非 3'非翻译区长度大于 800 个碱基，此时一些非翻译序列可能也被包括进来了。 |
|---|---|
| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 实验前准备 1.1 材料 样品 RNA：poly（A）＋或总 RNA，有义转录库对照 1.2 试剂 SuperScript cDNA kit （Life Techologies） T7T24引物 RNA 酶抑制剂（Life Technologies 或 Ambion 公司） 无 RNA 酶水（DEPC处理过的水，玻璃蒸馏） 25：24：1 （V/V/V）酚：氯仿：异戊醇（分子生物学级） 7.5 mol/L 乙酸铵 无水乙醇 无 RNA 酶的 70％ 乙醇（预冷至 -20℃） 10×转录缓冲液（Ambion） 10×rNTP 混合液 100 mmol/L DTT 10 mmol/L Bio－ll－CTP 和 Bioll－UTP （Enzo Diagnostics） 2500 U/ul T7 RNA 聚合酶（Epicentre） RNeasy 小柱带RLT和RPE 缓冲液及收集管（Qiagen） 5×片段化缓冲液 20×SSPE （Bio－Wh1ttaker） 0.5％ （V/V） Triton X－100 （分子生物学级；Sigma）溶于无 RNA 酶水 10 mg/ml 鲱精 DNA （Promega） 500 pmol/L Bio948 20×反义转录库对照 6×SSPET： 6×SSPE 含有 0.005％ （V/V） Triton X－100 1.3 耗材 热循环仪（例如 Perkin－Elmer 公司 9600 型 PCR 仪，带热盖） 0.1～10 ul 带滤芯枪头（Continental） Lyophilizer （冻干机） 小薄壁PCR管 GeneChip （Affymetrix） 1～200 ul 带滤芯凝胶上样枪头（Fisher） Rotisserie 式摇床（Appropriate Technical Resources） 50℃ 加热炉 2. 在 PCR仪上设定下列程序： 10 min 70℃ 65 min 37℃ （用总 RNA 时 50℃） 150 min 15.8℃ 无限 4℃ （保温） 3. 用下列试剂为每个RNA 样品配 10 ul 第一链混合液，用带滤芯的枪头： 4 ul 5×第一链缓冲液 200 pmol T7T24 引物 1 ul RNA 酶抑制剂 1 ul 200 U/ul SuperScript Ⅱ 逆转录酶 加无 RNA 酶的水至 10 ul 4. 将每个RNA样品与有义转录库对照混合。每 1 ug poly（A）＋样品加 5 ul 对照或每 10～20 总 RNA 加 1 ml 对照。冷冻干燥至每管体积小于 10 ul， 加无 RNA 酶的水 至10 ul。同时用手预热第一链混合液。 5. 将每份 RNA 转移到小薄壁 PCR 管中，放进 PCR 仪，启动所设程序（第一步）。 6. 70℃ 那步完成后，在温度降到 37℃（或 50℃）2 min 的时间里，加入预热（手中）的第一链混合液（每管 10 ul）。 7. 在合适的反应温度继续保温60 min。 8. 每管配制 130 ul 第二链反应混合液： 91 ul 无 RNA 酶的水 30 ul 5×第二链缓冲液 3 ul 10 mmol/L dNTP 1 ul 10 U/ul E.coli 连接酶 1 ul 2 U/ul E.coli RNA 酶 H 4 ul 10 U/ul E.coli DNA 聚合酶 这个混合液可以先配制，在冰上至多放置 90 min。 9.当 PCR 仪温度降到 15.8℃ 时，每管加入 130 ul 第二链反应混合液（总共 150 ul）。用枪头反复吸放混匀，在此温度下保温＞2h。 10. 加入 2 ul 5 U/ul 的 T4 DNA 聚合酶继续保温 5 min。把样品转移到冰上。 11. 加入 150 ul 25：24：1 的酸：氯仿：异戊醇，涡旋混匀，室温 13 000 g 离心 5 min。 12. 小心地将水相转移到一个新的管子，不要吸到中间相。加入 70 ul 7.5 mol/L 乙酸铵和 0.5 ml 无水乙醇后混匀。室温 13 000 g 离心 20 min。 13. 移去上清，沉淀用 0.5 ml 冷（-20℃） 70％ 乙醇洗涤，涡旋混合。 14. 室温 13 000 g 离心 10 min。移去上清，沉淀空气晾干几分钟。 15. 用 25 无 RNA 酶的水溶解 cDNA 沉淀并定量。 16. 每种 cDNA 样品，按下面组分配制一个反应体系： 100 ng cDNA 6 ul 10×转录缓冲液 6 ul 10×rNTP混合液 3 ul 100 mmol/L DTT 2.4 ul 10 mmol/L Bio－ll－UTP 2.4 ul 10 mmol/L Bio－ll－CTP 2 ul RNA酶抑制剂 2 ul 2500 U/ ul T7 RNA 聚合酶 无 RNA 酶的水配平到 60 ul 冰上可以放至多 3 h，用前升温到室温。 17. 37℃ 保温 8 h 至过夜。纯化前可以在 -80℃ 放置至多 48 h。 18. 加入无 RNA 酶水至 100 ul， 加入 350 ul RLT 缓冲液，混匀。加入 250 ul 无水乙醇，混匀。 19. 将每个样品上样到一个套进收集管内的 RNeasy小柱上。台式离心机室温 8000 g 以上离心 15 s。 20. 将柱子转到新的收集管，加入 500 RPE 缓冲液，台式离心机室温 8000 g 以上离 心 15 s。 21. 弃去流出液，将柱子重新放入此收集管。加入 500 ul RPE 缓冲液，台式离心机以最大速度离心 2 min。 22. 把柱子转移到一个新收集管。加入 50 ul 无 RNA 酶的水，8000 g 以上离心 1 min。 重复此步骤。合并两次洗脱液。 23. 在 260 nm 用分光光度法测 RNA 的量。 24. 取 10 体外转录的 RNA 用无RNA酶的水将体积配到 24 ul。加入 6 ul 5×片段化缓冲液。小心混匀，在 PCR 仪上 95℃ 温育 35 min。令其冷却到室温。-80℃ 可存放一年，用前 37℃ 融化 5 min。 25. 按下列组分为每个反应配 170 ul 杂交反应母液： 51 ul 20×SSPE 1.7 ul 0.5％ Triton X－100 1.7 ul 10 mg/ml 鲱精 DNA 20 ul 500 pmol/L Bio 948 10 ul 20×反义转录库对照 85.6 ul 无 RNA 酶的水 26. 每份 30 ul 片段化的转录 RNA 加入 170 ul 杂交反应母液。在热循环仪上以 99℃ 加热 10 min， 再移到 37℃放置 5 min 以上。 27. 微量离心机最大转速离心 5 min。 28. 从 GeneChip 的上层隔膜插入一个带滤芯的枪头形成出气孔。从芯片的下层隔膜用带滤芯的上样枪头加入 200 ul 杂交液。拿掉出气孔，用保鲜膜覆盖上下两层。 29. 在 rotisserie 式旋转仪上以 60 r/min 转速 40℃ 保温过夜（16～18 h）。 30. 将芯片转入 50℃ 加热炉，继续旋转芯片整整 1 h。 31. 从炉内拿出芯片。从上层隔膜处插入带滤芯的枪头。 32. 微量移液器按到底，将 200 ul 上样枪头从下层隔膜间插入。垂直拿起芯片，缓慢抽出所有杂交液并放进微量离心管内保存于 -20℃。 33. 将芯片内充满 6×SSPRET。 34. 按厂商的说明书洗涤芯片并用藻红素染色。尽快扫描芯片。 |
| 注意事项 | 1. 许多缓冲液和酶附带在 SuperScript cDNA 试剂盒里。附带的酶量不足的话可以单独从 Life Technologies 公司定购。 2. 所有需要控制温度的反应都在适当的热循环仪上进行。 |
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