cDNA 和体外转录产物的固相可逆固定(SPRI)纯化
实验方法原理 | 用基于磁珠方法纯化 cDNA 和体外转录产物避免了纯化过程有机溶剂的使用和离心步骤。这个方案与基本方案中的纯化方法相当(步骤 10~14 或者步骤 17~22)。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 实验前准备 1.1 材料 待纯化样品:cDNA(见基本方案步骤 11)或体外转录的 RNA(见基本方案步骤 19) 1.2 试剂 羧基端包埋的磁珠(cDNA 纯化:PerSeptive BioSystem; 体外转录纯化:Bangs Laboratories) 0.5 mol/L EDTA 3.5 mol/L NaCl/20%(m/V)PEG 8000(分子生物学级;无 RNA 酶) 70%(V/V)乙醇于无 RNA 酶的水 10 mmol/L Tris acetate, pH 7.8(无 RNA 酶) 1.3 耗材 磁力架(CPG) 2. 纯化 cDNA: 2. 1 每 150 ul cDNA 反应液取 10 ul 磁珠(Perseptive),将所需磁珠放.入同一个微量离心管。 2.2 把这个离心管放到磁力架上,让磁珠沉到一侧管壁。用枪小心地吸走上清。 2.3 加入与起始磁珠体积相等的 0.5 mol/L EDTA,轻轻摇振重悬磁珠。再次把管子放到磁力架上,待磁珠分离后,吸去上清。再重复此洗涤步骤两次。 2.4 用与起始磁珠体积相等的 0.5 mol/L EDTA 重悬磁珠。 2.5 每管 cDNA 加.入 150 ul 3.5 mol/L NaCl/20% PEG 8000 和 10 ul 磁珠,轻轻摇振或涡旋混匀。室温下放置 10 min。 2.6 把离心管放到磁力架上,让磁珠沉到一侧管壁(第一次约 2 min, 洗涤时可以快点)。 2.7 弃去上清,用 150 ul 70% 乙醇洗涤两次。最后一步尽量吸干乙醇,晾干 2 min。 2.8 加入 25 ul 10 mmol/L Tris-acetate(pH 7.8),室温放置 5 min 洗脱 DNA。 2.9 把离心管放到磁力架上,吸取并保存上清。 2.10 通过 PicoGreen 的荧光测定 cDNA 的浓度。 3. 纯化体外转录的 RNA: 3.1 每 60 ul 体外转录反应液取 20 ul 磁珠(Bangs Laboratories),将所需体积磁珠放进同一个微量离心管。 3.2 把这个离心管放到磁力架上,让磁珠沉到管壁一侧。用枪小心地吸走上清。 3.3 加入与起始磁珠体积相等的 0.5 mol/L EDTA,轻轻摇振重悬磁珠。再次把管子放到磁力架上,待磁珠分离后,吸去上清。再重复此洗涤步骤两次。 3.4 用与起始磁珠体积相等的 2.25 mol/L NaCl/10% PEG 重悬磁珠。 3.5 每管体外转录反应液加入 60 ul 3.5 mol/L NaCl/20% PEG 8000 和 20 ul 磁珠,轻轻摇振或涡旋混匀。室温下放置 10 min。 3.6 把离心管放到磁力架上,让磁珠沉到管壁一侧(第一次约 2mim 洗涤时可以快点)。 3.7 弃去上清,用 150 ul 70% 乙醇洗涤两次。最后一步尽量吸干乙醇,晾干 3 min。 3.8 加入 25 ul 10 mmol/L Tris-acetate(pH 7.8),室温放置 5 min 洗脱 RNA。 3.9 把离心管放到磁力架上,吸取并保存上清。 3.10 测定 260 nm 的吸收值,定量 RNA 浓度。 |