可以用各种方法分离基因组 DNA, 主要决定于初始材料的种类(血液还是组织)和数量。所有制备的 DNA 都应该储存于 pH8.0 的 TE 缓冲液中并装在灭菌的 Eppendorf 管内。本实验来源于 PCR 实验指南(第二版),作者:种康,瞿礼嘉。
试剂、试剂盒 | PCR 缓冲液ddH20基因组 DNAdNTP寡核苷酸引物 |
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仪器、耗材 | 离心机和转子丙烯酸防护板过滤阻挡吸头多道移液器PCR 仪托盘 固定器装置底座管盖小管 |
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实验步骤 | 一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
含 15 mmol/LMgCl2 的 10XPCR 缓冲液 (GeneAmpPCR 缓冲液 I,AppliedBiosystems)
灭过菌的 ddH20
2. 酶和酶缓冲液
TaqDNA 聚合酶,(AppliedBiosystems 或 Invitrogen)
3. 核酸和寡核苷酸
基因组 DNA
10 mmol/L dNTP(GeneAmpPCRdNTP 混合物,AppliedBiosystems)
寡核苷酸引物(Invitrogen 公司合成,稀释成 lOumol/L)
4. 离心机和转子
用翻转吊桶式转子和微板适配器离心
5. 专用设备
丙烯酸防护板(acrylicshield)
过滤阻挡吸头(filterbarriertips)
多道移液器(Eppendorf 或 ApogentDiscoveries)
PCR 仪,96 孔(AppliedBiosystemsGeneAmp9700)
托盘/固定器装置和底座,96 孔(AppliedBiosystems)
管盖,一条 8 个(USAScientific 或 AppliedBiosystems)
小管,0.2 ml,一条 8 个(USAScientific 或 AppliedBiosystems)
二、方法
1. 在冰上融化 dNTP、10XPCR 缓冲液和未标记的引物。Taq 酶在加入反应混合物之前应保存在-20°C。在丙烯酸防护板后融化标记的引物。
2. 每一个反应的混合物包括:
灭菌 ddH20 6.95ul
含 MgCl2 的 10XPCR 缓冲液 1.25ul
10mmol/LdNTP 0.25ul
10mmol/L 未标记引物 0.5ul
标记引物 0.5ul
在优化实验条件过程中,如果 PCR 产物的放射信号强度太低,可以增加标记引物的用量,同时按相应
比例调整 ddH20 的体积。
TaqDNA 聚合酶(终浓度为 0.25U) 0.05ul
对于一个 96 孔微孔板,准备用于 100 个反应的混合物。
3. 混匀,按等份加入放置在冰上的 PCR 板中(9.5ul/样品)。
4. 用多道移液器加入 3ulDNA(60ng),混匀。
5. 把盖子盖紧,将板放入预热到 94°C 的 PCR 仪中。
6. 如果产物大小是 200bp, 扩增 30 个循环。循环参数如下:94°C 初始变性 5 min;30个循环的 94°C 变性 30s; 根据经验确定的退火温度(Tm) 退火 30s;72°C 延伸 30s。最后一步 72°C 延伸 7 min。值可以通过引物序列计算出来,公式为 2(A+T)+4(G+C)。
7. 扩增完成后,将样品于-20°C 冻存,或者直接进入方案 3。 |
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