分子信标的设计
分子信标（Tyagi and Kramer 1996) 是另一种特异的荧光实时 PCR 探针（图 1), 这种分子信标可以在体内和体外动态地、实时地检测核酸 杂交事件（Tyagi and Kramer 1996; Kostrikis et al. 1998; Tyagietal. 1998)。
图1
分子信标是一段双重标记的寡核苷酸（25~40nt）形成具有一个环（探针）和一个自身互补的茎的发夹结构。荧光报告分子在 5'端，猝灭剂在 3'端。
室温条件下，分子信标形成发夹结构，荧光报告物质和猝灭剂分子通过探针自身互补形成的茎结构紧靠在一起，因此抑 制了荧光信号。
当 PCR 退火时，如果探针遇到靶 DNA 序列，根据热力学原理，信标将优先和靶 DNA 结合而 不是形成发夹结构。由于茎结构被破坏，荧光报告物质 与猝灭剂相互分离，报告物质得以发射荧光（见图1)。
传统的寡核苷酸杂交必须淸除未杂交的探针分子，以消除背景影响。利用分子信标的杂交在没有靶 DNA 存在的情况下荧光剂与猝灭剂可以稳定地结合在一起，不发射荧光，因而 背景很低。因此，可以省略清洗探针这一步，而且，随着扩增的进行，分子信标结合于靶 DNA 的比例逐渐增加，发射的荧光逐渐增强，因此荧光强度与 PCR 产物的累加是直接相 关的。
由于茎环结构很稳定，分子信标与线性 探针相比具有较高的选择能力，可以对只有一个 核苷酸差异的靶序列进行辨别，使其成为研究单核苷酸多态性（SNP） 的理想工具。完全匹 配的探针-靶 DNA 复合体比分子信标单链形成的发夹结构更为稳定，而发生错配的探针-靶 DNA 复合体一般不太稳定，即使只有一个碱基对的错配也如此，这一热力学特征是分子信 标高度特异性的基础。
分子信标在许多定性和定量检测研究中 应用越来越广泛。它被用于实时检测 DNA 扩增量的实时 PCR (TyagiandKramer 1996) 它可以用多种染料标记，用来进行实时荧光基因型鉴定（Kostrikisetal. 1998; Tyagietal. 1998) 和在医疗诊断时同时检测样品中不同的病原体（Vet etal. 1999)。
分子信标也可以在活体细胞中检测 RNA 转录物（Sokol et al. 1998)、检测 DNA 结合蛋白（HeydUkandHeyduk 2002)。分子信标还可以应用于实时 PCR、端点 PCR 和 RT-PCR 实验。
1. 设计路线
为了成功地检测 PCR, 分子信标必须在退火温度与靶 DNA 结合，而未结合的探针则保 持闭合的无荧光状态。退火温度和缓冲液会影响探针的特异性，师兄（师兄微信号：shixiongcoming）觉得这个必须要认真处理。loop 环（即探针区）应具有靶特异性，两侧可以形成发夹结构的互补序列。设计信标时，通常应遵循以下路线。
（1）探针区应为 15~33bp 长，且环序列必须与靶 DNA 序列互补。
（2）探针区的 Tm 值应该比 PCR 的退火温度髙 7~10 倍 (参照 GC 含量预测规则），而且 要在附加茎结构序列之前单独估测探针序列。
（3） 为了保证信标优先与靶序列杂交，探针必须与靶序列二级结构较少的区域互补。靶 DNA 的二级结构用序列分析软件分析，如 UNAFold(Michael Zuker，Rensselaer Polytechnic Institute, Http: //www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/)。
（4）分子信标应该结合于或靠近复制子的中间，上游引物 3'端和分子信标探针 5'端（茎）之间应大于 6bp。
（5）分子信标的茎区长度应为 5.7bp, GC 含量控制在 70%.80%, 茎部太长会使探针 与靶 DNA 结合速度减缓。
（6）茎区的长度、序列和 GC 含量应慎重选择，保证其解链温度比 PCR 引物的退火温度 髙 7~10°C
（7） 茎区解链温度一般用 Mfold 发夹折叠公式计算（UNAfold 软件的一部分），该公式用来 估测形成茎区双链分子的自由能，进而预测其解链温度。假如 GC 含量是 100%, 5bp 长的 茎的解链温度介于 55~60°C，6bp 长的茎的解链温度介于 60~65°C, 7bp 长的茎的解链温 度介于 65~70°C。
（8）一个序列的自由能越负，越优先形成发夹结构，而且越稳定。用 Mfold 得到的发夹 结构的自由能应介于 -3~ 0.5 kcal/mol (lcal=4.1840J) 之间。
（9）由于 G 碱基可以猝灭荧光，因此要避免 G 碱基与荧光染料（一般在茎区 5'端）直接毗邻，茎区 5'端为 C 较好。
（10）设计好的探针要检测是否存在其他二级结构而不是预先设计好的发夹结构，因为这 样会改变荧光染料与猝灭剂之间的相对距离，导致背景信号增强。
（11）要避免探针与引物之间互补，否则会导致引物与探针杂交，使背景增加。
（12）在分子信标 PCR 扩增中，复制子应相对较短，一般小于 150bp。分子信标是一种内在探针，必须与靶序列的互补链竞争。较短的复制子更容易完成 DNA 合成，以保证粑序列 完全合成，因此结果更为可靠。
2. 荧光团和猝灭剂的选择
在分子信标设计过程中，另一个需要考虑的因素是荧光标记物和猝灭剂。ciabcyl 【（4-二甲氨基苯基偶氮）安息香酸】是分子信标的首选猝灭剂，dabcyl 是一种中性疏水性分子，是多种荧光标记物的理想「伴侣」。与信标探针的总长度相比，ciabcyl 猝灭荧光探针的 作用范围很窄，这就意味着它必须与荧光团非常靠近才能有效地猝灭荧光，从而保证发夹结 构信标不发射荧光，而当探针与靶 DNA 形成复合体时会发出荧光。
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参考文献：
蒂芬巴赫.「PCR实验技术指南」
Breslauer K.J., Frank R., Blocker H., and Markey L.A. 1986. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 3746-3750.
Heyduk T. and Hcyduk E. 2002. Molecular beacons for detecting DNA binding proteins. Nat. Biotechnol 20; 171-176.
Kostrikis L.G., Tyagi S., Mhlanga M.M., Ho D.D., and Kramer F.R. 1998. Spearal genotyping of human alleles. Science 279: 1228-1229.
SantaLucia J., Jr. 1998. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest- neighbor thennodynamics. Proc. Natl. Acad. Set. 95: 1460-1465.
Sokol D 丄.，Zhang X., Lu P., and Gewirtz A.M. 1998. Realtime detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 11538-11543.
Tyagi S. and Kramer F.R. 1996. Molecular beacons: Probes that fluoresce upon hybridization. Nat. Biotechnol. 14: 303-308.
Tyagi S., Bratu D.PV and Kramer F.R. 1998. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16: 49-5).
Vet J.A., Majithia A.R., Marras S.A.E., Tyagi S., Dube S., Poiesz B.J., and Kramer F.R. 1999. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proc. Sci. 96:6394-6399.
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