胰岛素亲和层析实验

一次性小型塑料柱CentriconTM 浓缩器银染试剂盒

材料与设备

部分纯化的胰岛素受体，得自 WGA-琼脂糖柱层析（见本单元实验 3)

NaCl(5mol/L)

胰岛素琼脂糖（~2 ml 预装胶）（SigmaChemicalCo-)

一次性小型塑料柱（Bio-Rad Laboratories)

Centricon^TM 浓缩器（Amicon，Inc.)

银染试剂盒（Bio-Rad Laboratories 161-0449)

试剂

溶液 F

溶液 G

溶液 H

(配方，见 试剂的配制，pp.234~240)

操作程序

1) 加 0.75 ml 5mol/L NaCl 于经 WGA-琼脂糖柱部分纯化的胰岛素受体溶液（~3 ml) 中，调溶液 NaCl 浓度为 1mol/L。

2) 用 40 ml 溶液 F 冲洗胰岛素琼脂糖，去除可能影响固定化步骤的所有未偶联的胰岛素。

3) 将步骤 1 所得的混合液与胰岛素琼脂糖（每毫升受体溶液加 0.5 ml 胰岛素琼脂糖）混合，4℃ 孵育 18 h。

4) 待琼脂糖达到室温后，将其注入一次性小型塑料柱。室温下用 15 ml 溶液 F 洗柱。

5) 用 10 ml 溶液 G 洗脱胰岛素受体。分部收集 1ml 组分。

6) 用本单元实验 2(见 P.212) 所述的胰岛素结合试验法鉴定含胰岛素受体的组分。

7) 合并有胰岛素结合活性的组分，并用 Centricon 浓缩器浓缩之。这可除去许多水份和去垢剂（辛基β-葡糖苷的胶束大小约为 8000Da)。

8) 与等体积的溶液 H 混合，将 Triton X-100 重新加入浓缩的受体溶液。为得到高亲和性胰岛素结合活性和高的胰岛素刺激自磷酸化活性，有必要用 Triton X-100 替代辛基β-葡糖苷（Ridge 等，1988)。

9) 为证实所得产物确为胰岛素受体及其纯度，用 7.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定所分离蛋白的大小（见附录 5)。每孔加约 50ul 样品，其中一孔为分子量标准。电泳后，用银染试剂盒（silver stain plus kit) 对凝胶进行银染。