融合蛋白的酶解实验5

SDSGST清洗缓冲液GST洗脱缓冲液

水浴锅培养箱离心机

1.  在20或50 ml 带球旋盖的试管中，用20倍体积含1%Triton X-100的PBS液洗涤结合在谷胱甘肽-琼脂糖珠的GST融合蛋白。室温下，在台式离心机上以500 g 离心10 s 沉淀琼脂糖珠，小心弃上清，将谷胱甘肽-琼脂糖珠重悬于20倍体积的Triton X-100缓冲液中，重复洗涤1次。

2.  第二次离心后，小心弃上清，用20倍体积的GST洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽-琼脂糖珠。

3.  离心沉淀并弃去上清，将谷胱甘肽-琼脂糖珠重悬于20倍体积的凝血酶裂解缓冲液中，重复离心并再重悬于≤1 ml 的凝血酶裂解缓冲液中。 

4.  取出一小份重悬的琼脂糖珠，在其中加入等体积的2×SDS样品缓冲液，-20℃贮存以备SDS-PAGE分析用。

5.  将凝血酶以1%的比例加入剩余的谷胱甘肽-琼脂糖珠混悬液，25℃下保温反应1 h。

6.  用1柱床体枳的GST洗涤缓冲液洗脱已裂解释放的蛋白，如步骤1所述离心沉淀谷胱甘肽-琼脂糖珠，收集上清，重复5次，但分开保存毎次洗涤后的馏分，各取20 μl 用于SDS-PAGE。

7.  用GST冼脱缓冲液替换洗涤缓冲液，重复步骤6。洗脱与介质结合的GST。从毎个级分中取出20 μl 用于SDS-PAGE分析，以确定裂解程度，此胶上应包括步骤4留存的样品。