方案2 用于免疫沉淀的培养细胞的裂解实验
| 实验方法原理 | 培养的动物细胞一般使用温和去垢剂来裂解。如果低浓度的去垢剂就能引起细胞的充分裂解（如 l%NP-40 或 l%Triton X-100)，那么这对目标蛋白的影响可能比方案 1 中所讨论的匀浆方法更温和。去垢剂的选择必须根据免疫沉淀所用的抗体的识别表位的性质来决定。假如抗体识别线性抗原表位（如合成肽），那么可以使用强变性裂解缓冲液（如 RIPA 缓冲液）。另一方面，假如抗体识别有构象的表位，则应使用 NP-40 裂解缓冲液（或 1%TritonX-100)(裂解缓冲液细节见表 3.5)。 本方案由 Hong Ji(Joint Protomics Laboratory of the Ludwig Institute for Cancer Research,and Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research，Melbourne，Australia) 提供。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、方法 A: 单层培养的细胞的裂解1.去掉培养基，并用冷 PBS 洗细胞 2 次。 2.把培养瓶置于冰上。 3.100mm 的培养瓶（预冷至 4°C) 中加入 10ml 裂解缓冲液，裂解缓冲液的体积应根据培养瓶的大小来调整。 4.冰上孵育细胞 10~30 min(取决于所孵育的细胞系），并不时地摇动瓶子。 5.在冰上倾斜瓶子，使缓冲液流向一 边，用吸管将裂解液转移到一’个微量离心管或其他合适的离心管中。其他培养瓶均如此操作。 有些研究者喜欢把细胞从培养瓶中刮下来，但这可能产生细胞张力，只在特殊情况下使用。 6.4°C 条件下 20000g离心裂解液 10min。 7.小心地把上清移到另一个试管中，应确保不要碰到沉淀物。将裂解液放置于冰上，以备免疫沉淀所用（见 Harlow and Lane，1999） 细胞裂解液可以使用干冰和乙醇的混合物迅速冰冻，一70°C 条件下可以长期储存。但是，通过免疫沉淀分离的蛋白复合物的分析，建议使用新制备的细胞裂解液。 二、方法 B: 悬浮生长的细胞的裂解1.细胞在 480 g的离心力条件下离心 10 min，弃去上清。 2.用冷 PBS 洗细胞两次，然后将洗过的细胞置于冰上。 3.重新悬浮沉淀，使 1.0 ml 裂解液（冷却到 4°C) 中含大约 1X107~5X107 个细胞。 4.冰上孵育细胞 15 min，并不时地振动小管。 5.4°C 条件下 20000 g 离心裂解液 10 min。 6.小心地把上清移到另一个小管中，应确保不要碰到沉淀物。将裂解液置于冰上，以备免疫沉淀所用（见 Harlow and Lane，1999)。 细胞裂解液可以使用干冰和乙醇的混合物迅速冰冻，-70°C 条件下可以长期储存。但是，通过免疫沉淀分离的蛋白复合物的分析，建议使用新制备的细胞裂解液。 展开 |
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