方案7 从包含体中溶解大肠杆菌重组蛋白实验
| 实验方法原理 | 由于分子克隆技术能够使细菌高水平表达蛋白，因此原核表达是一个非常便利的获得重组蛋白的系统。遗憾的是这些蛋白在细菌中易于聚合和沉淀，形成难溶解的包含体，因而很难纯化。非细菌蛋白的包含体尤其普遍。虽然没有一种可用于所有蛋白的普适方法，还是有许多策略适用于包含体蛋白的溶解。本方案描述的就是这些策略之一。溶解包含体蛋白时要考虑许多步骤： 1.细胞裂解； 2.包含体的分离； 3.洗涤包含体； 4.溶解包含体； 5.重组蛋白的复性（假如需要）。 首先，在溶解之前洗涤包含体对于除去非目的蛋白和非蛋白物质是很重要的一步。比如，用1 mol/L的盐酸胍洗涤包含奋可以从重组蛋白IL-2(Weir，etal，1987)中除去污染蛋白，而4.0 mol/L 脲可用来洗涤IL-6包含体（Zhang,et al，1992)。除去非蛋白物质（类脂）也是很重要的，这可以防止RP-HPLC层析柱被阻塞，延长层析柱的使用寿命。这可以通过用4.O mol/L脲（Zhang,etal，1992)洗包含体或用正丁醇 10 mmol/L EDTA(Weir，et al,1987)提取包含体来加以解决。然而由于空气的氧化作用，一些目的蛋白将重折叠（如IL-6,[Zhang,etal,1992])。诱导蛋白正确折叠的常用方法是在有硫醇试剂（如1mmol/L DTT)存在的条件下，通过稀释和透析来逐渐降低去垢剂的浓度，促使二硫键的正确形成。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1.如实验方案6所述裂解细胞。 2.4°C 条件下23000 g离心细胞裂解液30 min。 3.倒出上清，测定沉淀的湿重。 4.用约 10倍体积的洗涤缓冲液重悬沉淀，室温搅动悬浮液lh。 5.4°C条件下23000 g 离心混合物30 min。 6.除去上清，并重悬沉淀。 7.重复4~5步骤3次以上（直到重组蛋白的纯度>80%，用分析级 SDS-PAGE 来判断）。 8.溶解步骤7的沉淀物，每克湿重沉淀（由步骤3决定）加人约 8 ml 的溶解缓冲液，在 4°C条件下温和搅动混合物 16~20 min。
其他的溶解缓冲液： （1）8mol/L 盐酸胍，10 mmol/L DTT，50 mmol/L Tris-Cl(pH8.5) 每 12~15 g 湿重的收集细胞用 15 ml 溶液溶解。37°C 孵育混合物 1h (Weir，et al，1987)。如步骤9（1） 所述变性蛋白。 （2）8mol/L脲素，2 mmol/L 还原型谷胱甘肽/0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽。 每克湿重包含体沉淀使用 9 倍体积的缓冲液。室温孵育混合物 lh。蛋白浓度不要超过 2.5 mg/ml(Bollag，et al,1996)。如步骤9（2） 所述复性蛋白。 9.特定目的蛋白的重新折叠所需的最适条件必须通过预实验来选择。复性条件包括： （1）用 1.5/mol/L 硫酸铜、50 mmol/L Tris-Cl(pH8.5) 溶液将可溶性沉淀稀释 25 倍，至终浓度为0.04 mol/L DTT、0.24mol/L 盐酸胍和约1.4 ug/ml 的目的蛋白（Weir，et al，1987)。20°C 孵育混合物 2 h。 （2）缓慢将 9 倍体积的 50 mmol/L 磷酸盐、50 mmol/L NaCl 和 1 mmol/L EDTA(含 2 mmol/L 还原型谷胱甘肽/0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽）加人溶解的沉淀中。25°C 孵育混合物 2?4 h。 10.用适合于目的蛋白的浓缩步骤来回收重折叠的蛋白（如 RP-HPLC、冻干或超过滤)。 展开 |
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