在培养基中处于对数生长期的大肠杆菌

Benzonase二硫苏糖醇（DTT)抽提液Na2EDTA苯甲基硫酰氟（PMSF)

冷冻离心机圆锥形离心管超声波仪

1.将培养基装人质量已知的瓶子或管子中，12000 g、4°C 离心 5 min，以沉淀大肠杆菌。

2.弃去上层清液，完全吸干离心管。称量瓶子或管子的毛重，去除皮重以确定大肠杆菌的重量。

3.在冷抽提液中重悬沉淀，每 1g 细胞用 1Oml 抽提液。将细胞悬液转移到塑料圆锥形离心管中。每 1Oml 抽提液加 1 ul (500U)Benzonase 和 100ul 100 mmol/L PMSF。每加人一次液体之后都要上下颠倒混匀。将试管放在盛有冰的烧杯内。

4.在细胞悬液中，用超声波处理细胞。将超声波仪的输出功率设定为最大值。每 15s 进行一次超声处理，每次超声处理之后冷却细胞悬液，重复多次直到细胞悬液清澈。

5.每 1Oml 提取液中加0.5 ml 1.2mol/L DTT，颠倒混匀，将试管在冰上放置 15 min。

6.每 1Oml 提取液中加 100 ul 200 mmol/L Na₂EDTA, 颠倒混勾。

7.将裂解液转移到离心管中，20000 g、4°C 离心 15 min。

8.测定上清液中的蛋白质浓度。

9.将上清液分成若干份，每 lOOul 为 1 等份。如果不立即用于 IEF，将其储存在-80°C，避免多次反复冻融造成的副作用。

10.依方案 5 的步骤来完成第一向 IEF。对于第一向 IEF，蛋白质浓度应为 5~10 mg/ml。样品可用水化液稀释到准确浓度。