氨基酸代谢标记实验_备择方案 1 对贴壁细胞

PBS(冷冻)37℃ 脉冲标记培养基

100 mm 组织培养皿配有液体同位素垃圾阀门的真空吸气器

1. 在 100 mm 组织培养皿中培养细胞到 80%~90% 融合（0.5 × 10⁷~2 × 10⁷ 细胞，取决于细胞类型）。

2. 如上所述制备 [³⁵S] 甲硫氨酸的工作液体（见基本方案步骤 1）。

3. 吸弃上清并用 10 ml 预热（37℃）脉冲标记培养基轻柔洗细胞 2 次，弃掉洗液。

4. 加 5 ml 预热脉冲标记培养基，在潮湿、37℃、5% CO2 培养箱内孵育 15 min，以除去细胞内的甲硫氨酸。

5. 弃掉细胞上的培养基，加入 2 ml [³⁵S] 甲硫氨酸的工作液体（见步骤 2），在 CO2 培养箱内孵育 10~30 min。

6. 弃掉细胞上的培养基。用 10 ml 冷冻的 PBS 洗细胞并弃掉 PBS。加 10 ml 冷冻的 PBS，并用塑料刮子或橡胶细胞刮小心刮取收集细胞。

7. 转移悬液到 15 ml 离心管中，4℃，300 g 离心 5 min，弃上清。如果在标记过程中细胞明显脱落，有必要将含有 [³⁵S] 甲硫氨酸的工作液中的细胞小心刮取，并将悬液转移到 15 ml 离心管中，在用 PBS 洗涤前离心。

8. 可选：通过 TCA 沉淀法测定标记掺入的量（见辅助方案）。

如果在标记过程中细胞明显脱落，有必要将含有[35S]甲硫氨酸的工作液中的细胞小心刮取， 并将悬液转移到15 ml离心管中，在用PBS洗涤前离心。

１. 实验材料中贴壁细胞，如 HeLa、NRK、Ml、COS - 1、CV - 1，或原代培养的成纤维细胞或内皮细胞。

２. 如果细胞沉淀不马上使用的话，见基本方案步骤7。