野生型杆状病毒草地夜蛾（Sf9）细胞高滴度的重组杆状病毒储液

PBS1 × SDS 样品缓冲液10% 胎牛血清

Graces昆虫细胞培养基（不含甲硫氨酸／不含甲硫氨酸和半胱氨酸）EXPRE 35 S 35 STNM-FH昆虫培养基60 mm 组织培养皿27℃ 培养箱（湿度可选）15 ml 聚丙烯离心管Beckman GPR 离心机沸水浴／100℃加热板超声仪

1. 接种 2.5 × 10⁶ 细胞于盛有 3 ml 含 10 % 胎牛血清的 TNM - FH 培养基的 60 mm 组织培养皿中。对每一假定重组病毒分别制备一个培养皿供感染用，并制备一个对照培养皿供野生型杆状病毒感染。

2. 27℃ 温育 1 h，使细胞贴壁。吸出培养液，然后加入 1 ml 重组病毒或 1 ml 含野生型病毒的培养液，感染复数（MOI）为 5～10。室温温育 1 h。

3. 将每个培养皿中的培养液移去后，再往其中加入 3 ml 含 10% 胎牛血清的 TNM-FH 培养液，27℃ 温育 24～48 h。

4. 小心去除培养液，用不含甲硫氨酸或不含甲硫氨酸和半胱氨酸的培养液洗细胞 1 次，加入 1 ml 不含甲硫氨酸或不含甲硫氨酸和半胱氨酸的培养液，27℃ 温育 30 min，然后每个培养皿中添加 EXPRE³⁵S³⁵S 至 0.25～0.5 μCi。27°C 温育 3～4 h。

5. 将每个培养皿的细胞和培养物上清分别移至一支 15 ml 聚丙烯离心管，4°C 1000 g 离心 10 min。

6. 按照基本方案1，步骤 1.5～1.7 或 2.5～2.7，处理并分析细胞（非分泌型重组蛋白）或上清（分泌型重组蛋白）。如果有适用的抗体，建议将标记的裂解物先进行免疫沉淀，然后在 SDS 样品缓冲液中煮沸，并在SDS-PAGE 中分离。

7. 用放射自显影使蛋白质显迹。从放射自显影图查看感染了重组病毒，而不是野生型杆状病毒的细胞是否出现预期分子质量的蛋白质。

使培养皿倾斜，在一个角上移出和加入培养基以避免旋起单层细胞。