D-PBSA胰蛋白酶

适合细胞生长的培养液藻酸钠溶液

无菌滤器

盐溶液，含有：

(a)NaCl，8.0 g

(b)D-葡萄糖，1.0 g

(c)用 UPW 配制1 L

(d)用 HCl 或 NaOH 调整 pH 为 7.2~7.4

(e)高压灭菌

0.1 mol/L CaCl₂，含有：

(a)盐溶液，500 ml

(b)CaCl_2· 2H₂O，7.35 g

(c)用 HCl 或 NaOH 调整 pH 为 7.2~7.4

(d)高压灭菌

1. 按 1.5 % 浓度将藻酸盐溶解于盐溶液中，在室温下将溶液搅拌至少 4 h，直至藻酸盐完全溶解。溶解于盐溶液的藻酸盐可以在4℃条件下储存 3 d。

2. 用灭菌的无热源活性的 0.45 um 滤器将藻酸盐过滤 3 次。最后一次过滤应当在藻酸盐使用前进行。

3. 将细胞培养至汇合状态。

4. 用 3 ml 胰蛋白酶（适合于细胞传代培养的浓度）消化细胞，然后细胞计数。

5. 将细胞离心（900 r/min，4 min ) 后，完全弃去含有胰蛋白酶的上清液。

6. 通过将细胞轻轻地悬浮于藻酸盐中，使细胞与藻酸盐混悬，调整细胞密度为 2x10⁶ 个/ml。此刻，在藻酸盐中不产生气泡是至关重要的，因为产生气泡将会导致微珠内形成空隙。

7. 将藻酸盐悬浮的细胞转移入套有 27G 针的无菌注射器中。

8. 利用迂冋运动将藻酸盐细胞悬液滴加入含有 0.1 mol/L CaCl₂ 的烧杯中，CaCl₂ 诱发藻酸盐微珠的形成。

9. 使微珠胶化 10 min，然后用 D-PBSA 洗 3 次。

10. 最后用生长培养液洗微珠。

11. 将微珠放入含有生长培养液的 175 cm² 培养瓶中，在 37℃、100 % 相对湿度和 5% CO₂ 条件下培养。