D-PBSA0.25%天然胰蛋白酶单层细胞二氧化碳

培养液和培养液容器旋转培养瓶血细胞计数板或电子细胞计数器和计数用液体旋转架

1. 用胰蛋白酶消化细胞，以通常密度种植。

旋转瓶中的气相较大， 故用基于 Hanks 盐和空气气相的培养基，可能需要向培养瓶内充入少量 5% CO₂ （如 10 L/min，2 s）。如果培养液是用 CO₂/HCO₃ 缓冲的， 气相应该用 5% CO₂ 调整（20 L/min，30s~1 min，以瓶的大小决定）。

2. 将培养瓶放在旋转架上，以 20 rph 的速度转动，直至细胞贴壁（24~48 h ) 。

3. 细胞密度增大时，加快旋转速度至 60~80 rph。

4. 给细胞加培养液或收集培养液时，可将培养瓶取到无菌工作区，如通常一样排出培养液，然后更换新鲜培养液。假如体积不是关键问题，输血装置或培养液袋对于添加新鲜培养液是有用的。如果培养液容量至关重要，可用吸管滴加或用一个蠕动泵计量。

5. 收获细胞：

(a)弃去培养液，用 50~100 ml D-PBSA 浸洗细胞，然后弃去 D-PBSA。

(b)在 4℃条件下，加入 50~100 ml 胰蛋白酶。用手或放在旋转架上以 20 rpm 将培养瓶转动 15 s。

(c)吸出胰蛋白酶，将培养瓶内的细胞消化 5~15 min，然后加入培养液。

(d)摇晃和转动培养瓶，用滴管将细胞洗出。