胶原酶血清

Cord Buffor硫酸链霉素生埋盐水EDTA-Na明胶

插管止血钳注射器手套丝线饭盒匀浆机离心机振荡器培养瓶CO孵箱显微镜超净工作台孔板

一、脐带内皮细胞的分离

　
1.  脐带收集

用无菌止血钳夹闭脐带两端，在止血钳外侧剪断脐带，放入盛有4 ℃Cord Buffer的饭盒内。脐带在4 ℃放置不应超过24 小时。

2.  脐带内皮细胞分离

　　
（1）带无菌手套，取出脐带，在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球消毒后，用无菌剪刀将两端脐带剪除。

（2）在脐带一端找到静脉，插入脐带静脉插管，用2 根粗丝线扎牢，用Cord Buffer抽吸有的30 ml注射器冲洗静脉腔，至将脐血洗净。

（3）赶出静脉腔内残余液体，将脐带另一端用止血钳夹闭，用10 ml注射器连接针头，注入37 ℃预热的0.1 ％胶原酶约6-8 ml，放入37 ℃ Cord Buffer中保温6-10 min。

（4）吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液，加入预加有20 ml Cord Buffer的离心管中，冲洗静脉腔，一并加入离心管中。

（5）离心，1500 rpm，10 min弃上清，用5～7 ml 20 ％FCS，RPMT 1640重悬细胞，转入培养瓶，放5 ％CO孵箱。

二、牛下丘脑内皮细胞生长因子粗提物的制备

　　　　　　　
1.  取新鲜牛下丘脑，加1.5倍体积的冰生理盐水用组织匀浆机匀浆，每次0.5 min，共6次。

2.  在4 ℃条件下用震荡器机械震荡约1.5 h。

3.  离心，10000 g，40 min，收取上清液。

4.  按0.5 ％加硫酸链霉素，4 ℃过夜。

5.  离心，20000 g，40 min，收取上清液。

6.  用紫外分光光度测280 nm，260 nm OD值按公式计算蛋白含量。

　　　　　　　　　　
7.  过滤，分装，-20 ℃保存备用。 

三、内皮细胞的培养与鉴定

1.  培养瓶包被明胶

培养瓶（25 cm）中加入0.2 ％明胶3 ml，使其铺满瓶底，放4 ℃备用。用前弃去明胶溶液。

　
2.  原代培养

将从脐带静脉中收集到的内皮细胞移入包被明胶的培养瓶（25 cm），加5～7 ml 20 ％小牛血清199培养基，按终浓度分别为20 μg/ml和100 μg/ml加入内皮细胞生长因子粗提物和肝素。每3～4 天换液1 次。

　
3.  传代培养

待内皮细胞生长铺满瓶底后即可传代。吸去培养基，用无血清RPMI1640 2 ml洗培养瓶1 次。加入0.1 ％胰酶、0.02 ％EDTA-Na 3 ml，放37 ℃孵箱。待镜下见大多数细胞卷缩变圆，可加入含血清培养基3 ml，以终止胰酶的消化作用，用弯头滴管吹打。收取细胞悬液，加入离心管中，离心1500 rpm，10 min。弃上清，以完全培养基重悬细胞，移入培养瓶扩大培养。

　
4.  内皮细胞鉴定

光镜下内皮细胞为多角形或梭形，可见1～2 个清晰的细胞核。透射电镜下， 部分内皮细胞中可有特征性的Weible-Palade小体存在。间接免疫荧光染色，内皮细胞为ⅧR∶Ag阳性。

四、牛下丘脑内皮细胞生长因子粗提物活性的测定

　
1.  0.1 ％胰酶0.02 ％EDTA消化收获内皮细胞，计数，调整细胞数至5×10⁴ /ml。

2.  细胞悬液加入包被明胶的96孔板，每孔100 μl，5×10³个细胞。

3.  放置于5 ％CO孵箱，24 h，待细胞全部贴壁生长。

4.  每孔加待检样品100 μl，每个稀释度设3个复孔，并设培养基阴性对照。

5.  放5 ％CO孵育，48～72 h，待阴性对照与阳性有明显差别时，加³HTdR，每孔0.5 μci/50 μl。

　　　　　　　　　　　　　　　　
6.  放5 ％CO孵箱，继续培养12 h。

7.  细胞收集仪收集细胞，检测Cpm值可计算刺激指数。

1.  严格无菌操作，防止在分离、培养和传代内皮细胞过程中发生污染。

　　
2.  胶原酶消化时所需浓度，时向要进行预试。如胶原酶浓度过高，内皮细胞容易死亡；浓度过低，则细胞收获量低。

　　
3.  内皮细胞应进行鉴定，以防将成纤维细胞误认为内皮细胞。