一、分离驱动蛋白
1. 以每克组织 1.5 ml PME 缓冲液的比例进行组织匀浆，匀浆物在 39000 g 离心 30 分钟。
PME 缓冲液：
0.1 mol/L PIPES，pH 6.9
2 mmol/L EGTA
1 mmol/L MgSO4
1 mmol/L DTT ( 或 DTE )
0.1 mmol/L GTP
2. 转移上清并在 100000 g 离心 1 小时。
3. 转移上清，加紫杉醇至 20 μmol/L，根据所研究组织的特征上升到一定温度培养 15~30 分钟。
4. 39000 g 离心 30 分钟收集微管。
5. 转移上清，加入三磷酸腺苷双磷酸酶使浓度为 2 单位/ml，在 25℃ 孵育 30 分钟。
6. 从冰箱拿出一份不含微管相关蛋白的紫杉醇稳定的微管，加到二磷酸腺苷双磷酸酶处理的上清中，使终浓度为 0.1 mg/ml。所加微管可以是通过用盐抽提紫杉醇稳定的微管或通过紫杉醇诱导用磷酸纤维素纯化的微管蛋白二聚体进行组装时制备的。
7. 加 5'-腺苷酰亚氨基二磷酸（AMP-PNP ) 使浓度为 0.5 mmol/L。根据所研究组织的特征，上升到一定温度培养 30 分钟。
8. 以 39000 g 离心 30 分钟沉淀微管和与其结合的驱动蛋白。
9. 去上清，用含 0.1 mmol/L AMP-PNP 和 20 μmol/L 紫杉醇的 PME 缓冲液重悬沉淀物。
10. 以 39000 g 离心 30 分钟收集微管和与其结合的驱动蛋白。
11. 去掉上清。用少量含 20 μmol/L 紫杉醇和 10 mmol/L Mg-ATP 的 PME 重悬沉淀物。根据所研究组织的特性，上升到一定温度培养 30 分钟。在温育期间，不经常地用巴斯德吸管上下吸溶液来轻轻搅拌。
12. 如步骤 10 离心，分离这时已经从微管释放出来的驱动蛋白。
二、分离细胞质动力蛋白
1. 以每克组织 1.5 ml PME 缓冲液的比例进行组织匀浆，匀浆物在 39000 g 离心 30 分钟。
PME 缓冲液：
0.1 mol/L PIPES，pH 6.9
2 mmol/L EGTA
1 mmol/L MgSO4
1 mmol/L DTT ( 或 DTE)
1.0 mmol/L GTP
2. 转移上清并在 100000 g 离心 1 小时。
3. 转移上清并加入二磷酸腺苷双磷酸酶使浓度为 2 单位/ml，在 25℃ 温育 30 分钟。
4. 在步骤 3 温育的时候，从冰箱拿出一份不含微管相关蛋白的紫杉醇稳定的微管，加到步骤 3 二磷酸腺苷双磷酸酶处理的上清中，使终浓度为 0.1 mg/ml。微管可以是通过盐抽提用紫杉醇稳定的微管或通过用紫杉醇诱导组装磷酸纤维素纯化的微管蛋白二聚体而制备的。调整紫杉醇至 20 μmol/L，根据所研究组织的特性，上升到一定温度培养 30 分钟。
5. 以 39000 g 离心 30 分钟收集微管和与其结合的动力蛋白。
6. 去掉上清，用含 20 μmol/L 紫杉醇的 PME 重悬沉淀物，并如步骤 5 收集微管。
7. 去掉上清。用少量含 20 μmol/L 紫杉醇和 10 mmol/L Mg-ATP 的 PME 重悬沉淀物并根据所研究组织的特性，上升到一定温度培养 30 分钟。在温育期间，不经常地通过巴斯德吸管上下吸溶液来轻轻搅拌。
8. 如步骤 5 离心，分离这时已经从微管中释放出来的动力蛋白。
三、通过蔗糖梯度离心分离驱动蛋白和动力蛋白
1. 用含 0.1 mmol/L GTP 和 1 mmol/L ATP 的 PME 缓冲液准备 5%~20% 的蔗糖梯度。
PME 缓冲液：
0.1 mol/L PIPES，pH 6.9
2 mmol/L EGTA
1 mmol/L MgSO4
1 mmol/L DTT ( 或 DTE)
0.1 mmol/L GTP
1 mmol/L ATP
2. 把含 ATP 释放的驱动蛋白和/或细胞质动力蛋白的样品（总体积最多不超过 1 ml）加样到梯度上。
3. 样品用 Beckman SW41 转头在 4℃ 以 31500 r/min 离心 16 小时。
4. 收集梯度溶液，每管 0.5 ml。 展开 | 
首页
