细胞膜的制备方法实验——分离顶层膜、基底膜或中间膜

阳离子硅胶微型离心机临床台式离心机超离心机吊桶式转头离心管

1. 制备下列溶液：

(1) 包被缓冲液（CB）

20 mmol/L MES

135 mmol/L NaCI

0.5 mmol/L CaCl₂

1 mmol/L MgCl₂

pH 5.5

(2) 1% 溶于 CB 缓冲液的阳离子硅胶

(3) 溶于 CB 的 1 mg/ml PAA

用 NaOH 和 pH 试纸调节 pH 值到 5.5。

(4) 含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液

(5) 70% Nyoodenz，配法同总细胞膜的分离

2. 准备下列仪器：

微型离心机

临床台式离心机

超离心机

吊桶式转头和合适的离心管

5 ml 注射器

18 G 针头，去掉针尖，磨钝并压扁针头以使之能喷出扇形细滴液体

橡皮淀帚或细胞刮

中等大小探头的超声仪

有碎冰的浅盘

小铝碟或铜碟：要能放在浅冰盘上以在超声处理过程中支撑培养皿于冰上，能允许较好的热交换以减小冰融化后培养皿倾倒的可能性。

3. 取生长于细胞培养皿上的汇合或部分汇合的细胞。35 mm 培养皿最好，与细胞汇合后 8 个平皿可以提供 10⁷ 个细胞。

4. 用无血清培养基或含有 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS 溶液洗涤细胞 2 次。

5. 培养皿放到冰盘上的铝碟或铜碟上。用 1 ml 4℃ CB 洗细胞一次。细胞和溶液在以下所有步骤中都要保持 4℃。

6. 倒掉 CB，加 1 ml 1% CB 溶液中的硅胶以包被顶层膜，放置 1 分钟。

7. 倒掉硅胶溶液，加 1 ml CB。

8. 倒掉 CB 溶液，加 1 ml 1 mg/ml PAA/CB，放置 1 分钟。

9. 倒掉 PAA/CB 溶液，加 1 ml CB。

10. 倒掉 CB 溶液，短吋间加 1 ml 含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液并快速倒掉缓冲液。再加 1 ml 含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液并置冰上 15~30 分钟以溶胀细胞。

11. 用压扁了的接在注射器上的针头将 1 ml 裂解缓冲液喷洒在单层细胞上，以 45° 角喷射以加以强大的剪切力。

12. 整个培养皿底部全部处理完成后，将裂解物倒入 50 ml 的锥形离心管中。基底膜在裂解过程中通常会贴附在培养皿底。在处理其他培养皿的时候，用 1 ml 裂解液覆盖基底膜并置于冰上。

13. 将所有细胞皿中残留的裂解物混合加到第 12 步用过的离心管中。将培养皿立起来以确保取到尽可能多的裂解物。照第 15 步的方法将硅胶包被的顶层膜与中间膜和细胞核分离开。

14. 用下面两种方法中的任何一种收集基底膜：

(1) 直接溶于含 2% SDS 的裂解缓冲液中

① 往每个平皿中加 0.1 ml 2% SDS，用橡皮淀帚将细胞膜刮起来。

② 收集 SDS 溶液并煮沸，直到细胞膜完全溶解。

(2) 对于需要非变性蛋白的生化分析

① 在不含去污剂的裂解缓冲液中用橡皮淀帚将基底膜刮起来，每个平皿用大约 0.1 ml 裂解缓冲液。

② 收集所有裂解物到一个离心管中，用微型离心机 14000 g 离心 15 分钟沉淀基底膜。

③ 取出并去掉上清，基底膜沉淀可以溶解于 2% SDS 中并煮沸。

15. 用上述分离总细胞膜方案的 12~17 步中描述的一步或两步法将硅胶包被的顶层膜同中间膜分离。