细胞膜的制备方法_从生长于微载体上细胞中分离细胞膜

CB

微型离心机临床台式离心机超离心机吊桶式转头离心管振荡器尼龙单丝网探头超声仪

1. 准备下列仪器：

微型离心机

临床台式离心机

超离心机

吊桶式转头和合适的离心管

振荡器

尼龙单丝网，孔径约 50 μm

探头超声仪

2. 将微载体培养物转移到 50 ml 的锥形离心管中。

3. 用无血清培养基或含有 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS 溶液洗涤微载体上的细胞两次。

4. 用冰冷 CB 洗涤细胞一次。

5. 微载体在 1 g 重力下下沉的过程中，锥形离心管要埋在冰里。

6. 倒掉 CB 溶液，加 5 ml 有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液。让珠于下沉，吸掉裂解缓冲液上清，加 5 ml 新的有蛋酶抑制剂的裂解缓冲液。

7. 让珠子下沉，置冰上 30 分钟。

8. 振荡珠子以裂解细胞，不时用相差显微镜监控样品的裂解程度。

9. 细胞完全裂解以后，用 50 μm 尼龙单丝网过滤珠子混合物以滤出微载体珠子：将尼龙单丝网覆盖在 50 ml 锥形离心管上，将珠子混合物通过尼龙网倒入离心管中。

10. 用裂解缓冲液洗涤微载体珠子一次，并将洗下来的液体与原来的顶层膜混合。照第 13 步的方法将硅胶包被的顶层膜与中间膜和细胞核分离开。

11. 将留有微载体的尼龙网上下翻过来覆盖于一个干净的 50 ml 锥形离心管上，用新鲜裂解缓冲液将微载体从尼龙网上洗到离心管中，让微载体珠沉下来。去掉裂解缓冲液上清，用小体积的含 2% SDS 的裂解缓冲液将基底膜从微载体珠上溶解下来，收集基底膜。

12. 将混合物经过微型离心管中的尼龙网以去除微载体珠，弃去微载体，煮沸 SDS 溶解的基底膜部分。煮沸后通过沉淀去除任何残留的二氧化硅，将含有溶解的基底膜的 SDS 溶液保存于 -20℃ 或 -80℃ 待用。

13. 用一步或两步法将硅胶包被的顶层膜同中间膜分离。