人胚胎干细胞系:衍生与培养—小鼠胚胎饲养细胞的制备

2.3 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞（MEF) 的 制 备

最广泛地用于支持 h E S 的伺养层细胞来自小鼠胚胎 [丁]^〇 1113 〇 1161&1,， 1998;Reu-binoffetal. ， 2000]，如小鼠胚胎饲养细胞（MEFs) ，尽管它们可能是最原始的间叶细胞的前体细胞。

每一 种 h E S 细胞系在不同的词养层细胞上的生长可能不同，这点要注意，对于高效率的增殖有些饲养层细胞比另外一些细胞更合适，通常要传 5〜10代以确保细胞适应于新的伺养细胞。始终要做到只要细胞培养标准条件改变，就要对细胞的核型稳定性和多能性进行严格的核查。方 案 2. 1 介绍了原代 M E F 细胞的分离培养。

2.3.1 原代培养

小鼠胚胎饲养细胞能够从妊娠〗15.5 —— 16.5 天 的 小 鼠 胚 胎（E15.5〜E 16.5 ) 中分离出来，培养过程易于生长，是一种可靠的、持 续 的 饲 养 细 胞 的 来 源 ，并能在液氮中维持很长时间。 MEFs 通常是在复苏之后 2〜5 天使用。方 案 2 . 1 是 由 N agy 等人的方 案 修 改 而 来 [2003]

方 案 2.1 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞（M E F s) 的 原 代 培 养

试剂与材料

无菌或无菌制备

□ MEFM (见 2. 2. 3)

□ 无 Ca2+ 和 Mg2+ 磷 酸 盐 缓 冲 液（PBSA)

□ 胰 蛋 白 酶 ， 0 . 2 5 % , 用 GIBCO 溶 液 A 配 制（参 见 2. 9 节）

□ 乙 醇 7 0 %

□ 75 cm2 培养瓶

□ l0 cm Petri 培养皿，塑料的，非组织培养级别

□带螺盖的离心管 ， 15m l 和 50 ml

□用于解剖的镊子和解剖刀（使用之前高压消毒并保存在 70% 酒 精 中 )

□可更换的解剖刀片， 1 1 号

非无菌

□计时妊娠鼠， 15.5〜16.5 天（经典常用的小鼠品系包括 SV 129 和C 57： BL)

步骤

(a) 处 死 妊 娠 15. 5〜16. 5 天的小鼠。

(b) 用 70 % 酒精擦洗鼠的腹面。

(c) 剪开皮肤和组织暴露子宫。

(d) 取出子宫角并放到含有 P B S A 的 10 cm Petri 塑料皿里。

(e) 用解剖刀从胚囊中取出胚胎，丢弃其他所有的组织包括胎盘以及胎膜。

(f) 取出含有脑组织的头的上部并丢弃。

(g) 沿着从头到尾的中轴从幼崽前端开始切开胚胎进行解剖，暴露及丢弃内部器官。

(h) 把胚胎剩余部分放在 50m l 离心管里用 P B SA 洗 4 遍 。

(i) 把胚胎剩余部分转人干净的 10 cm Petri 皿 中 ，去 掉 PBSA ，把胚胎用新的解剖刀切 成 2 mm 大小的小块。

(j) 把切碎的胚胎放到 15m l 离心管里，加 人 IOml 0 . 2 5 % 的胰蛋白酶，在 37°C 孵育 10〜20 min。

(K) 使小块沉淀下来，从孵育管中取出 5m l 胰蛋白酶以及分散的细胞，并且放到无 菌 的 50m l 的离心管里。

(l) 加人等体积的 M EFM 抑制胰蛋白酶活性。

(m) 再 加 人 5 ml 0. 2 5 % 胰蛋白酶到原先的含有胚胎的 15m l 离心管里，并 在 37°C再 孵 育 10’〜20 min

(n) 重 复 步 骤（k) ，（I), (m ) ，大 约 进 行 5 次孵育，将所有加人的胰蛋白酶以及分散的细胞放人同一个 50m l 离心管。只有没溶解的软骨将被留在原先的含有胚胎的15m l 管中。

(O) 用力地分散胰蛋白酶消化的细胞悬液并允许剩余的小块沉淀。

(P) 取出并保存上清液，去除沉淀。

(q) 离心上清液， l000 g ， 5 min

(r) 用 IOml MEFM 重悬沉淀并用台盼蓝计数活细胞数

(s) 每 个 160 cm2 培养瓶接种 5 X IO⁶ 细胞，再 加 人 IOml MEFM。

(t) 在 37°C 、5 % C02 温箱里孵育过夜。

(u) 第二天，用 20m l 的新鲜的 M EFM 培养基置换旧的培养基以去除细胞的碎片。

(V) 在冻存之前使细胞长到 8 0 % 〜9 0 % 汇合。

注意： 要 确 保 MEFs 细胞完全没有被任何微生物所污染，每次从小鼠胚胎新制备MEFs, 要在无抗生素的培养基中至少连续传]5 代 ，在这个时期如果没有观察到微生物污染，那么早期传代的细胞就可以扩增，并大量分装冻存起来，随后能够安全地用于日常 H ES 细胞的增殖。

2.3.2 M E F s 的继代培养

为了维持细胞库的供应以及避免出现先前讨论过的细胞衰老，关注 M E F s 的传代次数是关键，简而言之，应该以较低传代次数（p 〇〜p2 ) 的细胞用于维持细胞库，以较高传代次数（P3 和 p4 ) 的细胞用于制备无活性的可支持 h E S 细胞的询养层。 M EFs细胞在 4 代以后不能使用，这很重要，因为这个时期细胞已经衰老并可能很难扩增了。

M E R s 将在 75 cm2 或 225 cm2 的组织培养瓶中生长，这主要取决于需要多少飼养细胞（M E F s)s 在制备饲养层细胞板时，一个 75 cm2 培养瓶的 M E F s 如果灭活时达到80% 汇合，就可以为 2〜6 个 4 孔培养板提供细胞.s.—个 225 cm2 培养瓶的 M E F s 可用于大量储存细胞或者用来制备大量无活性的饲养层细胞板 a, 在进行 h E S 细胞培养工作
之前. ，有必要准备好充足的细胞储备供应，要确保饲养细胞不短缺。用 225 cm2 培养瓶的大量传代将提供更快的 M E F s 细胞储备，因此方案 2. 2 讨论了一个 225 cm2 培养瓶的M E F s 细胞传代的容量问题。为了工作容量进行传代，可 将 一 个 的 培 养 瓶 平均分为 3 份，而每个 225 cm2 培养瓶的 M E F s 细胞应该按 1 :3 的比例再产生三个 225 cm2 培养瓶的 M E F s 用于储备。

方 案 2.2 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞（M E F s) 的 传代

试剂与材料

无菌或无菌制备

□0〜3 代的 M E F s 大约 80% 汇合， 75 Cm2 或 225 cm2 培养瓶

□ MEFM (见 2. 2. 3)

□明 胶（高温高压灭菌， 0. 1% W /V

□ 胰 蛋 白 酶 ， 0 . 2 5 % ，溶 于 GffiCO 溶 液 A ( 见 2. 9 节)

□ PBSA

□台盼蓝活性染色

□ 离 心 管 ， 15 ml

□ 组 织 培 养 瓶 ， 3 X 225 Cm2

□血细胞计数板

步骤

(a) 从 225 cm2 培养瓶中吸出培养基并用 IOml 的 P B SA 洗一次细胞。

(b) 力口 3m l 的胰蛋白酶并在 37°C 孵育细胞 4 min。

(c) 从孵箱里取出培养瓶并轻轻地敲击使 M E F s 进一步脱离培养瓶。

(d) 加 入 6m l 的 M EFM ，打散所有细胞确保没有粘连并防止成团。

(e) 将培养基和悬浮细胞转人 15m l 离心管中。

(h) 离 心 5m in， lOOOg。

(g) 把 5 ml 0. 1 % 明胶加人 3 个新的无菌的并将有 M E F s 传 人 的 225 cm2 的培养瓶中 ，室温下与凝胶最少孵育 5 min 。

(h) 从离心管中取出 M E F s 并吸出培养基，敲击管壁分散细胞沉淀，用 3m l 新鲜的 M EFM 重悬。用吸管吹散细胞以确保细胞是单细胞悬液，这对于传代培养瓶中细胞的均一生长是必要的。

(i) 从每个新的培养瓶中吸出 5 ml 0 . 1 % 明胶，加 入 25 ml M EFM 培养基。

(j) 把 3m l 的 M E Fs 分配 到 3 个 225 cm2 培养瓶中。

(k) 每 个 225 cm2 培养瓶中的细胞在下次传代时将继续分 3 份 。

来自前三代的 M E F s 细 胞（P0〜P3 ) 的每一代都能冻存起来维持细胞的储备或者被传代 为 h E S 细胞的增殖提供饲养细胞（见 2. 3. 5 节）。

4 代之后， M E F s 应该被丢弃因为这些细胞可能衰老或发生改变。

2.3.3 冻存小鼠胚胎饲养细胞

如 果 M EF 细胞要用于 hES 细胞的培养过程，那就必须维持大量的、高质量的、不同代（PO〜P4) 的 MEFS 冷冻贮存。传代次数早的细胞（p0〜p2 ) 应该作为细胞储备的种子细胞，它们可以继续传代，再次冻存以提供大量的更高代次的细胞（p3〜p4 ) 来 维 持 hES细胞的日常生长。一 个 7Scm2 培养瓶有 8 0 % 汇 合的 M EF 细胞将冻存产生一个冻存管的储
备细胞，一 个 225 cm2 培养瓶的细胞将冻存产生 3 个冻存管的储备细胞。

方 案 2.3 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞 的 冻 存

试剂与材料

无菌或无菌制备

□ 含 有 M EFs 细胞的 75 cm2 培养瓶或 225 cm2 培养瓶， p0〜p4， 8 〇% 〜 90% 细胞汇合

□ M E F M (见 2. 2. 3 节）

□ 胰 蛋 白 酶 ， 0 . 2 5 % ， ED TA，溶 于 GIBCO 溶 液 A (见 2. 9 节)

□ E S F B S

□ D M SO

□ P B S A

□ 离 心管， 15 ml

□冻存管

步骤

(a) 从 含 有 MEFs 细胞的培养瓶中去除培养基，并 用 P B S A 洗 一 遍 ，每 个 75 cm2培养瓶用 5 ml。

(b) 每 个 75 cm2 培养瓶中加入胰蛋白酶 lm l，确保整个培养瓶的单层细胞都能被覆盖 ， 37℃孵育 4min。

(c) 轻轻地敲打培养瓶使细胞进一步脱落。加 入 5 ml M EFM 终止胰蛋白酶反应，吹 散 5〜6 次确保所有细胞没有粘连并防止成团。把 含 有 M E F s 的 培 养 基 转 人 15m l 离心管。

(d) 离心 5 min， IOOOg

(e) 为冻存准备冻存管及写标签。标 签 内 容 应 该 包 括 M E F s 细胞新传代的代次,曰期和任何可能需要的信息。在无菌条件下将 lOOy DMSO 加人备好的冻存管里。

(f) 吸去上清，小心不要搅乱细胞沉淀。

(g ) 用 E S F B S 重悬细胞沉淀，每 个 75 cm2 培 养 瓶 900uI，用塑料吸管打散细胞，确认细胞沉淀已混勻。

(h) 把 含 有 M E F s 细 胞 的 E S F B S 转 移 到 装 有 DM SO 的冻存 管 里 ，立即储存到-80°C 冰箱过夜，储存之前要 彻底混匀。

(i) 第二天，把冻存管放到液氮里长期保存。

2.3.4 M E F s 细胞的复苏

从长期液氮保存中复苏 M E F 细胞，用于补充 M E F s 的储备或者用于灭活处理后支持未分化 hES 的 生 长 。

方 案 2. 4 复 苏 冻 存 的 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞

试剂与材料

无菌或无菌制备

□ 一 支 M E F s 冻存管

□ MEFM (见 2. 2. 3 节）

□ 明 胶 ， 0. 1 % (高温髙压灭菌)

□组织培养瓶， 75 cm2

□ 水 浴 箱 ，设置 在 37°C

□ 吸 管 ， Iml

步骤

(a) 在 75 cm2 培养瓶内加 3 ml 0 . 1 % 明胶，覆盖细胞将要黏附的表面，室温孵育至少 5 min

(b) 从液氮罐中取出一支 M E Fs 冻存管。

(c) 在 37°C 水浴箱中快速解冻细胞。

(d) 把 0. 1 % 明胶从 7 5 cm2 培养瓶中吸出并加入 7m l 的 M EFM 培养基。

(e) 用 Im l 吸管把含有 M E Fs 细胞的 E S F B S / D M S O 混合液从冻存管里转移到含有M EFM 培养基的 75 cm2 培养瓶中。

(f) 在 37°C 孵育细胞过夜。

(g) 第二天早上用新鲜的 M EFM 培养基替换 7m l 培养基去除残留的 DM SO 和细胞碎片。

(h) M E F s 细胞生长达 5 天或细胞汇合达到 8 0 % ，每 2 天换一次液。

2.3.5 基于化学方法的 M E R s 细胞失活

MEFs (P0〜P4 ) 是一种快速分裂的细胞，因而在作为饲养细胞层使用之前需要抑制有丝分裂避免其过度生长。细胞分裂的抑制可通过放射和化学阻断方法获得，最普遍的是使用丝裂霉素 C ，它是一种为日常培养 h E S 细 胞 而 准 备 M E F s 细胞的简单、有效的方法。

安全提示：对丝裂霉素 C 进行操作时一定要当心，因为它有遣传毒性。始终要戴手套，并且只能在 I I 类 通 风 橱（小的生物安全柜）内操作。

h E S 细胞的增殖需要使 M E F 细胞失活，一 个 75 cm2 培养瓶大约 8 0 % 汇 合 的 MEFs细胞通常能提供 2 〜4 个（取 决 于 M E F s 细胞的产量）4 孔板 。方 案 2. 5 讨论了一75 cm2 培养瓶或一个 225 cm2 培 养 瓶 的 M E F s 细胞的失活处理，使 用 225 cm2 培养瓶需
要 3 倍试剂和培养基。

方 案 2. 5 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞 的 生 长 抑 制

试剂与材料

无菌或无菌制备

□ 8 0 % 〜9 0 % 汇 合 的 M EFs 细胞， 75 cm2 培 养 瓶（或 225 cm2)

□ MEFM (见 2. 2. 3 节）

□ 胰 蛋 白 酶 ， 0 . 2 5 % ， 溶 解 于 GIBCO 溶 液 A (参见 2. 9 节）

□ PBSA

□ 明 胶 ， 0. 1 %

□ 丝 裂 霉 素 C (MMC), 50 ug /ml, 溶解 于 DMEM (过滤除菌）

□多孔培养板， 4 孔 ：通 常 每 75 cm2 培养瓶的 M E F s 细胞需 要 1 〜4 个培养板

□吸管

□ 离 心 管 ， 15 ml

步骤

(a) 用 MEFM 以 1 : 10稀释 MMC，从 50 Mg/ml 稀释至 5 ug/ml。

(b) 在 4 孔培养板的每个孔中加人0.5m l 的明胶。

(c) 从 孵 育 箱 里 取 出 75 cm2 培 养 瓶 ，内 有 8 0 % 汇 合 生 长 的 p3 或 p4 代 的 MEFs细胞。

(d) 用 IOmI 的 5ug/ml：MMC，在 37°C 孵育 MEFs 细胞 2 h。

注意：因为制备的 M E F 细胞可能有变化，新的使用者将要确定 M M C 完全抑制细抱分裂的最佳浓度和孵育时间。

(e) 在 M M C 孵育的期间，把 0 . 1 % 明胶涂到 4 孔板，至少在使用前 5 min 涂板。

(f) 用 M M C 处理完之后，用 5m l 的 P B SA 洗细胞一次。

(g) 加 Im l 胰蛋白酶，于 37℃孵育 4 min。

(h) 轻轻地敲击培养瓶使所有的细胞脱落，并加人等体积的 M EFM 终止胰蛋白酶反应，转 移 到 15m l 的离心管。

(i) 在 含 有 M E F s 细 胞 的 15m l 离 心 管 里 加 人 M E FM 培 养 基 使 总 体 积 达 到 6 ml，IOOOg 离心 5 min。

(j ) 吸去上清，用 5m l 的 M EFM 重悬 M E F 细胞沉淀，仔细确认是单细胞悬液。

(k) 用血细胞计数板计数细胞。

(l) 从 4 孔板吸掉明胶。

(m) 每 个 孔 以 7. 5 X 10⁴ 个 接 种 M E F s 细胞 ，并 且 每 个 孔 中 M E F M 的总量达到500ul。 M E F s 细胞将在 6 h 内贴壁。

(H) 把新接种的培养板放到孵育箱里，准备第二天使用。

注意： M E F 细胞在失活之后死亡之前，能够 作 为 h E S 细胞的饲养细胞来使用的时间 为 7 天，理想的情况是把 h E S 细胞传到 M E F s 细胞失活 1〜3 天内的培养板上。