过氧化物酶体的分离和分析实验3

离心机

1. 准备分析试剂：



缓冲液：可以采用 Tris-HCl（0.3 moI/L，pH7.5）或 MES（0.3 mol/L，pH 5.7）。

0.1 mol/L NaF

0.1 mol/L MgCl₂

脂肪酸含量低的 BSA ( ICN) -20 mg/ml H₂O

2. 向一只 16 mm x 125 mm 的螺口管中按顺序加入下列试剂：

缓冲液                   0.15 ml

BSA                       0.05 ml

棕榈酰辅酶A         0.05 ml

NaF                       0.05 ml

MgCl₂                    0.05 ml

DHA¹²P                 0.05 ml

用于分析的收集物（0~0.1 mg 蛋白质）

加 H₂O 至 0.6 ml 的体积

3. 将反应在 37℃ 保温 15 分钟。

4. 加入 2.25 ml 氯仿-甲醇（1:2）并混合均匀使反应终止。

5. 加入 0.75 ml 的氯仿和 0.75 ml 的 KCl-H₃PO₄（2~0.2 mol/L），振荡，在桌面离心机上离心 5 分钟（500~1000 g）。

6. 吸出上层并加入 2.5 ml 的 CH₃Cl-甲醇-H₂O (1:12:12) 及 0.1 ml ( 2 滴）的 6 mol/L H₃PO₄ 洗涤下层两次，振荡并离心使之分层。

7. 将等份的洗涤后的下层液（一般为 1 ml，即总体积的 2/3）转至计数瓶中，在通风橱中加热并吹入空气使瓶内的溶剂蒸发。

8. 向干燥的残余物中加入液闪试剂，混合后使之溶解，在液闪计数器上确定放射性。