实验步骤 | 观察一系列不同密度的细胞并摄影。
设备和材料
”培养瓶或培养皿中一系列不同密度的细胞,最好是同一正常或转化细胞(例如,3T3和SV3T3,或BHK21一C13和BHKZI一PyY)的不同密度情况,包括中期(大约5()%汇合,有明显的有丝分裂)、汇合(100%的生长面积覆盖了细胞,但没有堆积)和汇合后期(细胞长成多层,如果是转化细胞就会堆积)。如果可能的话最好有低密度和高密度的悬浮细胞。
2)如果可能,最好有已污染的培养物样本(最好不要是培养皿,以避免扩散的风险)和不健康的培养物,例如,很长时间没有换液的细胞。
3)倒置显微镜,配有 4X, 10X , 20X 相差物镜和聚光器。
4)自动相机,最好是带监控器的数码相机,或带摄影目镜的胶片相机。
标准方案
l)打开显微镜电源,调节灯光强度(见方案16.1)。
2)从孵箱中取出培养物。最好在同一时间检查少量培养瓶,而不要将很多培养瓶长时间放在孵箱外。取出一对培养瓶,例如,低密度和高密度的同一细胞,或者同一细胞类型的正常和转化状态。
3)用肉眼观察每一个培养物,注意培养基的混浊度、pH是否下降或分裂中的细胞。
努力辨识单层细胞,寻找图像的特征。可以选择正常形态,例如,成纤维细胞汇合时的旋涡图案(图16.Zb,h和彩图sb)。
4)在倒置相差显微镜低倍镜下观察(4x物镜)细胞密度和细胞间相互作用的特征。
5)在中倍率(10X物镜)和高倍率(20X物镜)物镜下观察细胞的健康状态(图13.1),聚拢的特征,单层细胞的收缩或分开。
6)观察有无污染的特征(图19.la~c)。
7)寻找有丝分裂并粗略估计发生频率。
8)给每一种培养物照相(见方案16.6),注意培养物的细节(细胞类型,最后一次传代的时间)和细胞密度,以及任何你感兴趣的特殊特征.,
9)将培养物放回解箱.取新的培养物垂复以上步孩。 补充方案:染色(见方案16.2,方案16.3);离心涂片(见方案16.4).间接免疫荧光(见方案16.11)。
实验变化
l)寻找相关培养物在生长模式、细胞密度和形态学方面的差异。
2)评估细胞的健康状态。
3)有无污染的迹象?
4)细胞是否准备好换液(见13.6.2节)或传代(见13.7.1节)?
5)通过计算20X物镜视野的面积和计数每个视野中的细胞数来从化地估计细胞密度.如果使用数码相机和监控器这就会变得很简单,可以川薄膜扭盖屏幕,用记号笔给每一个细胞做标记。
6)鉴别和计数这些高倍视野中处在有杖分裂,!,的细胞。
数据
定性
l)记录所有培养物在形态学、外形和生长形式方面的观察结果
2)注意任何污染物
3)确定健康状态及其他
定量
l)记录每一个培养物的细胞密度(细胞数 / cm2)。
2)记录每一个培养物的有丝分裂指数。
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