免疫球蛋白 G (IgG) 片段的水解

2019.4.06

zhaochenxu

致力于为分析测试行业奉献终身

一个新的抗体需要片段化的时候往往要进行摸索性的试验。选择反应时间的时候宁
可保留部分抗体不被完全降解，这样可以避免蛋白酶过分裂解后导致抗体结合位点的破
坏。

实验步骤	木瓜蛋白酶水解 IgG 成 Fab 片段摸索性试验此法适用于小鼠（任何亚类）、大鼠、人、山羊、绵羊、马、鸡、豚鼠和牛的 IgG水解。材料保存于 PBS (附录 1 ) 中的 2 mg/ml 纯化的 IgG (单元 1.5) 木瓜蛋白酶（2 X 结晶悬液； Sigma) 水解缓冲液：0.02mol/LEDTA (二钠盐）/0.02mol/L 半胱氨酸/PBS (新鲜配制，冰上保存< l0h) 溶于 PBS 的 0.3mol/L 碘乙酰胺（从结晶体新鲜配制； Sigma) PBS 自制的微量透析槽或微量透析盒（如 Slide-A-Iyzer 透析盒； Pierce) 1.将 IOOud 2 mg/m l 纯化的 IgG 加入标有 1〜2 4 的 24 个微量离心管中。充分混匀木瓜蛋白酶悬液，不能振荡。准备两种浓度木瓜蛋白酶，溶于 5m l 水解缓冲液中，浓度分别是 0.lmg/ml 和 0 .02 mg/ml。 2.将 100ul 0.1 mg/ml 木瓜蛋白酶液分别加入 8 个 IgG 离心管中（酶/抗体比例为 1 : 2 0 ) ，将 IOOmI 0. 02 mg/ml 木瓜蛋白酶液分别加入第二组 8 个 IgG 离心管中（酶/抗体比例为 1 : 1 0 0 ) ，最后，将 IOOmI 不含木瓜蛋白酶的水解缓冲液加入剩余的 8 个 IgG 离心管中（对照组），所有离心管盖上盖子。 3.将所有离心管置于 37°C 水浴，在不同时间取出一组离心管，制作水解时间曲线图。一组离心管指一个 E/A 比为 1 : 2 0 的水解管，一个 E/A 比为 1:100 的水解管和一个对照水解管。水浴 Ih 时取出第一组离心管，接着在第 2 h、 4 h、 6 h、 12 h、 18 h、 24 h 和48 h 分别取出第二至第八组离心管。取出一组离心管后每管加入 20M1 0. 3mol/L 碘乙酰胺中止水解。 4.用自制的微量透析槽或商品化的微量透析盒将水解混合物对 PBS 透析。 5.用 150 mmXl.5 mm 1 0 % 非还原 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（单元 12. 3 ) 分析水解产物，上样量为 80M 1。当凝胶上在 150kDa (表示未水解的抗体）和 120kDa (表示仅半胱氨酸起作用）处没有显示蛋白质条带时，酶切反应完全。选择水解 IgG 获取Fab 片段的最佳试验条件，按基本方案 2 进行试验。Fab 片段大小为 5 〇 kDa 左右， Fc 片段大小为 27kDa，在 24kDa 和 15kDa 处的细条带是一些不重要的水解产物。木瓜蛋白酶水解 IgG 获取 Fab 片段的大量制备用摸索性试验的方法确定获取 Fab 片段的最佳试验条件（见基本方案 1)。材料（带 V 项目见附录 1) 木瓜蛋白酶（2 X 重结晶悬液； Sigma) 水解缓冲液：0.02mol/LEDTA (二钠盐）/0.02mol/L 半胱氨酸/PBS (新鲜配制，冰上保存< l0h) 溶于 PBS (附录1 ) 中浓度> lmg/m l的 IgG (总量> 5 mg，单元 1. 5) 碘乙酰胺结晶 P B S ， p H 8. O 蛋白 A 交联琼脂糖凝胶 CL-4B 聚丙婦酰胺葡聚糖 S-200 Superfine (Pharmacia Biotech) V 硼酸盐缓冲液，可选 1 0 % (m/V) NaN3，可选 5 mmX IOOmm 层析柱（Bio-Rad) 26 mmX 900 mm 层析柱 (Pharmacia Biotech) 1.混匀木瓜蛋白酶悬液，避免振荡。加入与待水解抗体相等体积的水解缓冲液溶解木瓜蛋白酶，选择从摸索性试验中已确定的最佳酶量、抗体浓度和孵育时间进行实验。 2.将木瓜蛋白酶液加入浓度为溶于 PBS 的 IgG 中，混匀， 37°C 水浴至所需时间（从基本方案 1 中确定）。加入结晶碘乙酰胺至终浓度0.03mol/L 中止水解反应，小心混勻，确保碘乙酰胺完全溶解。 3.将反应液转至透析袋中（CPI 附录 3 H) ，在 4°C 下对 2LPBSpH8.0 透析 12〜20 h。 4.准备 5 mmX100 mm 蛋白 A 交联琼脂糖凝胶 CL-4B 层析柱（单元 1.5、 CPI 附录 31)，将透析液上样。收集含有 Fab 片段和酶的未结合流穿液。如有需要，用 PBS 充分洗柱，收集所有 Fab 片段。 5.将含有 Fab 片段的流穿液浓缩至≤5 ml (CPI 附录 3 H)。 6.将浓缩液上样至 26 mmX 900 mm聚丙烯酰胺葡聚糖 S-200 Superfine 层析柱，收集分子质量大小为50kDa 的组分，用 SDS-PAGE 法鉴定分子质量大小或使用预平衡的凝胶过滤层析柱。 7.将 1〜80M 1终产物用1 0 % 非还原 SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳鉴定终产物的纯度。通过测定A₂₈₀值，确定 Fab片段浓度（表 1.5.1)。将 Fab片段保存在硼酸缓冲液中，于 4°C 保存；或者保存在含0• 02%NaN3 的 PBS 中，于一 70°C保存。胃蛋白酶水解 IgG 成 F (ab’)₂片段的摸索性试验胃蛋白酶水解IgG 获取 F (al/)2 片段的大量制备备选方案用预先活化的木瓜蛋白酶水解IgG 制备 F (ab)2 展

实验步骤

木瓜蛋白酶水解 IgG 成 Fab 片段摸索性试验

此法适用于小鼠（任何亚类）、大鼠、人、山羊、绵羊、马、鸡、豚鼠和牛的 IgG水解。

材料

保存于 PBS (附录 1 ) 中的 2 mg/ml 纯化的 IgG (单元 1.5)

木瓜蛋白酶（2 X 结晶悬液； Sigma)

水解缓冲液：0.02mol/LEDTA (二钠盐）/0.02mol/L 半胱氨酸/PBS (新鲜配制，冰上保存< l0h)

溶于 PBS 的 0.3mol/L 碘乙酰胺（从结晶体新鲜配制； Sigma)

PBS

自制的微量透析槽或微量透析盒（如 Slide-A-Iyzer 透析盒； Pierce)

1.将 IOOud 2 mg/m l 纯化的 IgG 加入标有 1〜2 4 的 24 个微量离心管中。充分混匀木瓜蛋白酶悬液，不能振荡。准备两种浓度木瓜蛋白酶，溶于 5m l 水解缓冲液中，浓度分别是 0.lmg/ml 和 0 .02 mg/ml。

2.将 100ul 0.1 mg/ml 木瓜蛋白酶液分别加入 8 个 IgG 离心管中（酶/抗体比例为 1 : 2 0 ) ，将 IOOmI 0. 02 mg/ml 木瓜蛋白酶液分别加入第二组 8 个 IgG 离心管中（酶/抗体比例为 1 : 1 0 0 ) ，最后，将 IOOmI 不含木瓜蛋白酶的水解缓冲液加入剩余的 8 个 IgG 离心管中（对照组），所有离心管盖上盖子。

3.将所有离心管置于 37°C 水浴，在不同时间取出一组离心管，制作水解时间曲线图。一组离心管指一个 E/A 比为 1 : 2 0 的水解管，一个 E/A 比为 1:100 的水解管和一个对照水解管。水浴 Ih 时取出第一组离心管，接着在第 2 h、 4 h、 6 h、 12 h、 18 h、 24 h 和48 h 分别取出第二至第八组离心管。取出一组离心管后每管加入 20M1 0. 3mol/L 碘乙酰胺中止水解。

4.用自制的微量透析槽或商品化的微量透析盒将水解混合物对 PBS 透析。

5.用 150 mmXl.5 mm 1 0 % 非还原 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（单元 12. 3 ) 分析水解产物，上样量为 80M 1。当凝胶上在 150kDa (表示未水解的抗体）和 120kDa (表示仅半胱氨酸起作用）处没有显示蛋白质条带时，酶切反应完全。选择水解 IgG 获取Fab 片段的最佳试验条件，按基本方案 2 进行试验。Fab 片段大小为 5 〇 kDa 左右， Fc 片段大小为 27kDa，在 24kDa 和 15kDa 处的细条带是一些不重要的水解产物。

木瓜蛋白酶水解 IgG 获取 Fab 片段的大量制备

用摸索性试验的方法确定获取 Fab 片段的最佳试验条件（见基本方案 1)。

材料（带 V 项目见附录 1)

木瓜蛋白酶（2 X 重结晶悬液； Sigma)

水解缓冲液：0.02mol/LEDTA (二钠盐）/0.02mol/L 半胱氨酸/PBS (新鲜配制，冰上保存< l0h)

溶于 PBS (附录1 ) 中浓度> lmg/m l的 IgG (总量> 5 mg，单元 1. 5)

碘乙酰胺结晶

P B S ， p H 8. O

蛋白 A 交联琼脂糖凝胶 CL-4B

聚丙婦酰胺葡聚糖 S-200 Superfine (Pharmacia Biotech)

V 硼酸盐缓冲液，可选

1 0 % (m/V) NaN3，可选

5 mmX IOOmm 层析柱（Bio-Rad)

26 mmX 900 mm 层析柱 (Pharmacia Biotech)

1.混匀木瓜蛋白酶悬液，避免振荡。加入与待水解抗体相等体积的水解缓冲液溶解木瓜蛋白酶，选择从摸索性试验中已确定的最佳酶量、抗体浓度和孵育时间进行实验。

2.将木瓜蛋白酶液加入浓度为溶于 PBS 的 IgG 中，混匀， 37°C 水浴至所需时间（从基本方案 1 中确定）。加入结晶碘乙酰胺至终浓度0.03mol/L 中止水解反应，小心混勻，确保碘乙酰胺完全溶解。

3.将反应液转至透析袋中（CPI 附录 3 H) ，在 4°C 下对 2LPBSpH8.0 透析 12〜20 h。

4.准备 5 mmX100 mm 蛋白 A 交联琼脂糖凝胶 CL-4B 层析柱（单元 1.5、 CPI 附录 31)，将透析液上样。收集含有 Fab 片段和酶的未结合流穿液。如有需要，用 PBS 充分洗柱，收集所有 Fab 片段。

5.将含有 Fab 片段的流穿液浓缩至≤5 ml (CPI 附录 3 H)。

6.将浓缩液上样至 26 mmX 900 mm聚丙烯酰胺葡聚糖 S-200 Superfine 层析柱，收集分子质量大小为50kDa 的组分，用 SDS-PAGE 法鉴定分子质量大小或使用预平衡的凝胶过滤层析柱。

7.将 1〜80M 1终产物用1 0 % 非还原 SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳鉴定终产物的纯度。通过测定A₂₈₀值，确定 Fab片段浓度（表 1.5.1)。将 Fab片段保存在硼酸缓冲液中，于 4°C 保存；或者保存在含0• 02%NaN3 的 PBS 中，于一 70°C保存。

胃蛋白酶水解 IgG 成 F (ab’)₂片段的摸索性试验

胃蛋白酶水解IgG 获取 F (al/)2 片段的大量制备

备选方案用预先活化的木瓜蛋白酶水解IgG 制备 F (ab)2

展

实验步骤	木瓜蛋白酶水解 IgG 成 Fab 片段摸索性试验此法适用于小鼠（任何亚类）、大鼠、人、山羊、绵羊、马、鸡、豚鼠和牛的 IgG水解。材料保存于 PBS (附录 1 ) 中的 2 mg/ml 纯化的 IgG (单元 1.5) 木瓜蛋白酶（2 X 结晶悬液； Sigma) 水解缓冲液：0.02mol/LEDTA (二钠盐）/0.02mol/L 半胱氨酸/PBS (新鲜配制，冰上保存< l0h) 溶于 PBS 的 0.3mol/L 碘乙酰胺（从结晶体新鲜配制； Sigma) PBS 自制的微量透析槽或微量透析盒（如 Slide-A-Iyzer 透析盒； Pierce) 1.将 IOOud 2 mg/m l 纯化的 IgG 加入标有 1〜2 4 的 24 个微量离心管中。充分混匀木瓜蛋白酶悬液，不能振荡。准备两种浓度木瓜蛋白酶，溶于 5m l 水解缓冲液中，浓度分别是 0.lmg/ml 和 0 .02 mg/ml。 2.将 100ul 0.1 mg/ml 木瓜蛋白酶液分别加入 8 个 IgG 离心管中（酶/抗体比例为 1 : 2 0 ) ，将 IOOmI 0. 02 mg/ml 木瓜蛋白酶液分别加入第二组 8 个 IgG 离心管中（酶/抗体比例为 1 : 1 0 0 ) ，最后，将 IOOmI 不含木瓜蛋白酶的水解缓冲液加入剩余的 8 个 IgG 离心管中（对照组），所有离心管盖上盖子。 3.将所有离心管置于 37°C 水浴，在不同时间取出一组离心管，制作水解时间曲线图。一组离心管指一个 E/A 比为 1 : 2 0 的水解管，一个 E/A 比为 1:100 的水解管和一个对照水解管。水浴 Ih 时取出第一组离心管，接着在第 2 h、 4 h、 6 h、 12 h、 18 h、 24 h 和48 h 分别取出第二至第八组离心管。取出一组离心管后每管加入 20M1 0. 3mol/L 碘乙酰胺中止水解。 4.用自制的微量透析槽或商品化的微量透析盒将水解混合物对 PBS 透析。 5.用 150 mmXl.5 mm 1 0 % 非还原 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（单元 12. 3 ) 分析水解产物，上样量为 80M 1。当凝胶上在 150kDa (表示未水解的抗体）和 120kDa (表示仅半胱氨酸起作用）处没有显示蛋白质条带时，酶切反应完全。选择水解 IgG 获取Fab 片段的最佳试验条件，按基本方案 2 进行试验。Fab 片段大小为 5 〇 kDa 左右， Fc 片段大小为 27kDa，在 24kDa 和 15kDa 处的细条带是一些不重要的水解产物。木瓜蛋白酶水解 IgG 获取 Fab 片段的大量制备用摸索性试验的方法确定获取 Fab 片段的最佳试验条件（见基本方案 1)。材料（带 V 项目见附录 1) 木瓜蛋白酶（2 X 重结晶悬液； Sigma) 水解缓冲液：0.02mol/LEDTA (二钠盐）/0.02mol/L 半胱氨酸/PBS (新鲜配制，冰上保存< l0h) 溶于 PBS (附录1 ) 中浓度> lmg/m l的 IgG (总量> 5 mg，单元 1. 5) 碘乙酰胺结晶 P B S ， p H 8. O 蛋白 A 交联琼脂糖凝胶 CL-4B 聚丙婦酰胺葡聚糖 S-200 Superfine (Pharmacia Biotech) V 硼酸盐缓冲液，可选 1 0 % (m/V) NaN3，可选 5 mmX IOOmm 层析柱（Bio-Rad) 26 mmX 900 mm 层析柱 (Pharmacia Biotech) 1.混匀木瓜蛋白酶悬液，避免振荡。加入与待水解抗体相等体积的水解缓冲液溶解木瓜蛋白酶，选择从摸索性试验中已确定的最佳酶量、抗体浓度和孵育时间进行实验。 2.将木瓜蛋白酶液加入浓度为溶于 PBS 的 IgG 中，混匀， 37°C 水浴至所需时间（从基本方案 1 中确定）。加入结晶碘乙酰胺至终浓度0.03mol/L 中止水解反应，小心混勻，确保碘乙酰胺完全溶解。 3.将反应液转至透析袋中（CPI 附录 3 H) ，在 4°C 下对 2LPBSpH8.0 透析 12〜20 h。 4.准备 5 mmX100 mm 蛋白 A 交联琼脂糖凝胶 CL-4B 层析柱（单元 1.5、 CPI 附录 31)，将透析液上样。收集含有 Fab 片段和酶的未结合流穿液。如有需要，用 PBS 充分洗柱，收集所有 Fab 片段。 5.将含有 Fab 片段的流穿液浓缩至≤5 ml (CPI 附录 3 H)。 6.将浓缩液上样至 26 mmX 900 mm聚丙烯酰胺葡聚糖 S-200 Superfine 层析柱，收集分子质量大小为50kDa 的组分，用 SDS-PAGE 法鉴定分子质量大小或使用预平衡的凝胶过滤层析柱。 7.将 1〜80M 1终产物用1 0 % 非还原 SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳鉴定终产物的纯度。通过测定A₂₈₀值，确定 Fab片段浓度（表 1.5.1)。将 Fab片段保存在硼酸缓冲液中，于 4°C 保存；或者保存在含0• 02%NaN3 的 PBS 中，于一 70°C保存。胃蛋白酶水解 IgG 成 F (ab’)₂片段的摸索性试验胃蛋白酶水解IgG 获取 F (al/)2 片段的大量制备备选方案用预先活化的木瓜蛋白酶水解IgG 制备 F (ab)2 展

实验步骤