H I V 的检测与分析——感染CD4+原代细胞系及H I V 的诱导

感 染 CD4+ 原 代 细 胞 系 及 H I V 的诱导

基本方案1 用 H IV 体 外 急 性 感 染CD4 + 原代细胞及细胞系表

9.2.1列出了一些最常用于体外H I V 感 染 的 C D 4 + 靶细胞。用其他不同谱系的C D 4 + 细胞系也可获得相应的结果，还 有 一 些 C D f 细胞在一定的实验条件下也可被感染。

材 料

CD4+细 胞 系（表9.2.1)
与细胞系相适应的完全培养基（如 R P M I -I O 完全培养基；附 录 1)

基本方案2 建立H I V 慢性感染细胞系

材料

CD 4 + 细 胞 系（表9.2.1)

与细胞系相适应的完全培养基（如 R P M I -10完全培养基；见 附 录 1)

9 6 孔 、 4 8 孔 或 2 4 孔圆 底 微 量 滴 定 板（Costar)

1 . 按照基本方案1，步 骤 1〜5 , 用 H I V 感 染 C D 4 + 细胞系

2 . 按照基本方案1 ，步 骤 7 , 培养感染的细胞并观察合胞体及细胞死亡的出现。感染后每两天检测反转录酶活性以找出病毒产生的高峰时刻（见基本方案，步 骤 8)。

3 . 当病毒产量达到高峰时，将细胞重悬于完全培养基中。以 每 份 0. 2 个细胞/200ul 铺于 9 6 孔圆底的微量滴定板孔中。不用饲养细胞，进行有限稀释细胞克隆形成实验(如 单 元 1. 3)。

由 于 H I V 感 染 ，存 活 的 细 胞 常 丟 失 了 其 CD4 表 面 标 记 。病 毒 慢 性 感 染 并 不 引起 显 著 的 细 胞 病 变 。

4 . 培养细胞， 7〜14 d 后用倒置显微镜观察是否有克隆形成。

5 . 用 4 8 孔 或 2 4 孔圆底微量滴定板扩增一组克隆，通过测定上清中反转录酶活性或P24抗原含量来首次筛选H I V 的组成性表达。

6 . 选择、扩增并冻存高表达H I V 的细胞克隆。

7 . 用细胞系来研究H I V 表 达 的 诱 导（见基本方案3)。

基 本 方 案 3 慢 性 感染 细胞 系 中H IV 的诱导

本方案简述了对持续感染细胞系Ul (从 U 937细胞系产生；表 9. 2 . 1 ) 通过刺激剂进 行 H I V 诱导以检测这些刺激剂对病毒表达的诱导效应。

材料

慢 性 感 染 细 胞 系（见基本方案2)

刺 激 剂（如细胞因子、抗病毒药物和微生物制剂）

9 6 孔平底微量滴定板或组织培养瓶

1 . 将细胞系在对数生长期维持培养2〜3d 。不要让细胞浓度超过5 X I O ⁵个细胞/ml。

2.用台盼蓝拒染法估计细胞浓度及活力（附 录 3C )。如 果 细 胞 活 力 髙（> 9 5 % ) ，在室温下， 300 g 离 心 lOmin，将细胞按所需的终浓度（如 IX IO⁵〜2 X IO⁵个细胞/ml) 重
悬于完全培养基中。

3 .将细胞铺于无菌的9 6 孔平底微量滴定板或组织培养瓶中。

4.加入适当浓度的刺激剂（如 对 9 6 孔 板 加 入 180ul细 胞 悬 液 及 2〇 ul 1 0 倍浓度的刺激剂）。

5.培养细胞，每 24〜48 h 收 集 培 养 上 清（至 少 20〜30ul ) ，时间> 7 d ，依细胞系而定。上清储存于一 7 〇 °C ，收集完毕后按步骤 6 检测。

大 多 数 慢 性 感 染 细 胞 系 在 刺 激 后 4 8 〜 120 h 期 间 被 诱 导 释 放 的 病 毒 水 平 达 到最高。

6.—次性测定上清中 p24 抗原的含量或反转录酶的活性（单 元 9. 4)。图 9. 2, 2 显示的是 U l 细胞病毒表达的典型诱导曲线