1. 硅化规格相同的5 ml玻璃管,双蒸水冲净后烤干,每次实验分6~12组,每组5支试管 2. 将125I标记抗体和非标记抗体分别用结合缓冲液作倍比稀释 3. 在同一组5个试管中每管加入10 μl标记抗体,4、5管加入10 μl未标记抗体(浓度高于同组标记抗体100倍以上),1、2、3管补加10 μl结合缓冲液 4. 洗涤分离或培养的细胞,用结合缓冲液调整细胞浓度为5×105~1×106/80 μl,每管中加入80 μl细胞悬液 5. 轻轻振摇后在4 ℃条件下(冷室或冰浴上)孵育30 min 6. 将孵育后的细胞悬液叠加于预先置小塑料管内的200 μl分离液上 7. 台式高速离心机10000 g 2 min 8. 切下位于管底细胞小团 9. γ计数 计算
特异性计数值=总计数值(每组1、2、3管平均cpm值)—非特异性计数值(每组4、5管平均cpm值)。 结果用LIGAND和EBDA微机程序进行Scatchad分析,计算出细胞表面抗原密度以及抗原与抗体结合的亲和力。 展开 |