白细胞介素-2生物学活性检测

CTLL　

FCS RPMI16403H-TdRPPOPOPOP二甲苯MTTDMSO

培养板收集仪CO2孵箱计数仪

^一、3H-TdR掺入法

　　　　　　　　
1.  IL-2依赖的CTLL用10 ％FCS RPMI1640洗涤2 次，每次1000 rpm，5 min，除去原培养液中的IL-2

2.  调整活细胞数1×10⁵ /ml

3.  96 孔平底培养板中每孔加100 μl，CTLL悬液（1×10⁴ /孔）

4.  加入不同稀释度标准IL-2和待测样品

5.  37 ℃CO2孵箱，培养18～24 h

6.  每孔加³H-TdR 0.5 μci/50 μl，4-6 h

　　　　　　　　　
7.  用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上

8.  干燥后，移入液闪瓶中，加入1 ml闪烁液，于液闪仪中测β射线的cpm值

9.  计算（举例）

　　
将标准IL-2不同浓度和待测样品不同稀释度时所获得的cpm值作图，纵轴采用概率座标（probit），横座标为Log₂稀释倍数。从50 ％的最高cpm值画一横线，k标准和待检斜线的交点，即可计算出待检样品IL-2的活性单位。

　　
如标准品50 ％最大cpm值时为1 u/ml，则待测标本1∶4时为1 u/ml，原液则为4 μ/ml

二、MTT法
 

MTT（3-（4，5-dimcthylthioazol-2-yl）-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide，四甲基偶氮唑盐）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲　（Formazan），将结晶的溶解释放，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待检样品中IL-2的水平。在掌握良好的实验条件下，MTT法的敏感性可接近³H-TdR同位素掺入法。

　　　　　　　　
1.  IL-2依赖的CTLL用10 ％FCS RPMI1640洗涤2 次，每次1000 rpm，5 min, 除去原培养液中的IL-2

2.  调整活细胞数1～2×10⁵ /ml

3.  96 孔平底培养板中每孔加100 μl，CTLL悬液（1～2×10⁴ /孔）

4.  加入不同稀释度标准IL-2和待检样品，100 μl/孔，每份设3个重复孔

5.  CO₂孵箱培养18～24 h

6.  每孔加10 μl MTT（5 mg/ml溶于PBS），4 h，37 ℃

　　　　　　　　
7.  轻轻吸出150 μl上清，加入150 μl二甲亚砜（DMSO）或酸性异丙醇（异丙醇溶于0.04 N HCl）

8.  溶解10 min，测OD值（570 nM）

1.  CTLL细胞洗涤要充分，但操作必须轻柔，离心速度不宜过高，否则影响细胞的增殖。

2.  避免同位素污染。

　　
3.  加标准IL-2或待测样品时，按从低浓度到高浓度顺序加。

　　
4.  加入³H-TdR最适时机是阴性对照细胞开始全部死亡。

　　
5.  CTLL细胞冻存后复苏较困难，用含有丝分裂原条件培养基长期培养容易发生变异。