酵母转化实验_电穿孔转化

二硫苏糖醇山梨醇

电穿孔仪器电击池水浴锅

1.  实验前两天，将转化用酵母菌株的单菌落接种于5 ml YPD培养基中，30℃过夜培养至饱和。

2.  转化前一天晚上，在装有500 ml YPD培养基的2 L 无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液，于30℃剧烈摇动培养过夜，直到细胞密度达1×10⁸细胞/ml（OD600≈1.3~1.5，依据菌株不同而异）。
 

3.  于4℃以4 000 g 离心收获培养细胞，细胞用80 ml 无菌水重悬。为了增加细胞对电击的感受性，继续步骤4。如果这种处理并不需要的话，可接步骤6。

4.  加入10 ml 10×TE缓冲液，pH7.5。搖晃混匀，再加入10 ml 10×乙酸锂贮液，旋转摇匀，于30℃轻轻摇动45 min。

5.  加2.5 ml 1 mol/l DTT并同时旋转摇动，于30℃轻轻摇动15 min。

6.  将酵母菌悬液稀释在500 ml 水中、洗涤3次，每次以4 000~6 000 g 于4℃离心沉淀细胞，依次重悬细胞，所用的溶液如下：

（1）第一次沉淀：250 ml 冰冷的水

（2）第二次沉淀：20~30 ml 冰冷的1 mol/l 山梨醇

（3）第三次沉淀：0.5 ml 冰冷的1 mol/l 山梨醇

使用Bio-Rad公司的Gene Pusler：
 

9a.  往一个无菌、冰冷的1.5 ml 微量离心管加入40 μl 浓缩的酵母菌细胞和≤100 ng 待转化的DNA（体枳≤5 μl），混匀。

10a.  将酵母与转化DNA混合物转移到冰冷的0.2 cm 间隙的一次性电击池中。

11a.  以1.5 KV、25 μF、200 Ω 作脉冲转化，电路中应包括Bio-Rad脉冲控制仪，而这十分重要，如果不这样的话，将会损坏Gene Pulser。

12a.  往电击池加入1 ml 冰冷的1 mol/l 山梨醇回收酵母细胞，然后用无菌的巴斯德吸管轻轻吹吸混匀。

13a.  将酵母菌液直接涂布在山梨醇选择培养基平板上，于30℃培养3~6天，直到平板上出现菌落。

使用Life Technologies 的 Cell-Porator：

9b.  往一支无菌，冰冷的1.5 ml 微量离心管中，加入20 μl 浓缩的酵母菌和待转化的DNA。DNA用量要≤100 ng，体积≤5 μl。

10b.  将酵母菌/DNA混合物转移到0.15 cm 间隙的电转槽中。

11b.  以400 V，10 μF，低电阻下进行脉冲转化。

12b.  取10 μl 电转混合物加到1.5 ml 无菌的微离心管中，其中含有0.5 ml 冰冷的1 mol/l 山梨醇。

13b.  将酵母菌悬液直接涂布在山梨醇选择培养基平板上，于30℃培养3~6天，直到平板上出现菌落。